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一、目的
細胞及其在組織內的組織之間的關系對于理解正常發育和疾病病理至關重要。Visium空間基因表達解決方案可測量完整組織切片中的總mRNA，并繪制出現基因活性的位置的圖。
簡單說，就是將基因的表達情況與切片染色圖結合起來，在一個空間的維度上去理解基因表達的分布情況
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二、解決方案
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包括：
- 試劑
- 耗材
- 信息分析軟件
自己實驗室需要配備：
- 冰凍切片機
- 熒光顯微鏡
三、技術發展
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- 分辨率提升，有8w個UMI capture area，5000個點
- 每個點可以覆蓋1~10個細胞
四、新技術特點
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四、原理
出于組織學目的，對新鮮冷凍的組織切片進行成像，并將其放置在包含與RNA結合的捕獲探針的陣列上。將組織固定并透化以釋放RNA，使其與相鄰的捕獲探針結合，從而捕獲基因表達信息。然后從捕獲的RNA合成cDNA，并制備測序文庫。然后對文庫測序并可視化數據，以確定表達哪些基因，在何處表達以及表達多少。
五、流程概述
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技術要點：
- 新鮮的冰凍組織
- H&E染色 + 熒光顯微鏡掃描
- 測序
- 信息分析
PS：對于新的組織樣本等情況，在正式建庫前需要進行組織優化
組織優化：（非必須）
目的：找到一個最佳的條件（可能是透化時間的長短），使組織樣本中的mRNA能被最大化充分地釋放出來
由此產生了一個試劑盒TOkit（組織優化試劑盒）和 GEX slide(Gene Expression試劑盒) 基因表達試劑
六、兩種試劑盒
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-
TO kit (Tissue Optimization)組織優化試劑盒
- 可通過8個Capture Area對同一個樣本設置8個不同的優化條件（例如透化時間等）
- 一個包裝4張slide,可做四種不同樣本的優化測試
-
GEX slide(Gene Expression試劑盒) 基因表達試劑
- 每張slide有4個Capture Area
- 兩種規格：一張silde(4個反應） 或 4張slide（16個反應）
七、實驗流程
1. 組織優化（可選）
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- slide上的oligo上沒有相應的barcode
- 目的只是幫我們找到組織釋放出最多mRNA的實驗條件
- 對組織進行染色、透化之后，進行cDNA合成，而在dNTP上有SN3的熒光基團，便可通過熒光顯微鏡進行判斷哪個實驗條件下的組織切片所釋放mRNA量最多
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- 1號為陰性對照
- 不同樣本的透化時間都不相同
2. 透化與建庫
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-
slide的結構
- 4個Capture Area
- 每個Capture Area尺寸為6.5mm x 6.5mm
- Capture Area中總共有約5000個capture mRNA的點
- 每個capture mRNA的點上有百萬個oligo
- 每個capture mRNA的點，點的直徑為55μm，點與點之間的中心距離為100μm
-
每個oligo結構：
- read1
- Sptial barcode： 用于回溯空間位置信息
- UMI ： 用于無偏計數分析
- oligo(dT)： 用于捕獲真核生物RNA的PolyA尾巴
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- 對經過OTC包埋的新鮮冷凍組織進行切片，并將之放置捕獲區域上
- （用甲醇）對組織進行固定、H&E染色，拍攝明場圖片
- 對組織進行透化
- 釋放出的mRNA的PolyA尾結合探針的oligo(dT)，反轉錄成cDNA
- cDNA擴增、純化和質控；
- 片段化，末端修復，加A和連接頭；
- 樣本index PCR， 制備測序文庫。
- 最后進行上機測序
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- 注意：應用了雙重索引，i5和i7
-
而且對read2的長度也很有要求
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已經經過測試的樣本：
小鼠與大鼠
image.png人類
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比較難操作的樣本：
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八、分析流程
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- Cell Ranger1.0.0
- cellranger makefastq
- cellranger count
- Loupe Browser4.0.0
- 可視化
九、結果展示
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十、自己的一些思考
- 加上了雙重索引、載玻片上的探針，還有捕獲區域上的對齊邊框，既優化了性能，又使得這項技術已經很難再用其他廠商的試劑盒替代，太會玩了。
