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A Guide to Using the Spatial Transcriptomics Spot Detector 2.0
Github上原文：https://github.com/SpatialTranscriptomicsResearch/st_spot_detector/wiki/ST-Spot-Detector-Usage-Guide
該工具允許通過平滑，整潔且直觀的Web界面檢測和導出ST數據集的點坐標，以正確可視化數據。
一、瀏覽器選擇
需要具有HTML5支持的現代瀏覽器。Chrome，Firefox和Safari的最新版本應該可以使用。必須啟用JavaScript。
二、實操
第一步：上傳圖片
注意：該工具已經過優化，可以處理直接從ST協議拍攝的圖像。必須旋轉圖像，以使框簇( frame cluster )出現在圖像的左上方。只要外部框架完好無損，也可以裁剪它們。將圖像縮小到原始圖像40％的圖像可能有效，但不能保證提供結果。
選擇所需的Cy3熒光圖像進行斑點檢測。
可選：如果需要組織檢測，還可以上傳HE明場圖像（HE bright field image）。
-
單擊“上傳圖像”（由于所有計算和斑點檢測將在后臺執行，因此需要花費幾分鐘。STSpot檢測器將顯示正在執行的操作和剩余時間）。
上傳圖像
上傳圖像
第二步：圖像對齊
注意：如果未上傳HE圖像和/或圖像先前已對齊，則可以跳過此步驟。
此步驟中的思想是找到參考點（HE圖像中的斑點或Cy3圖像中的組織覆蓋物），以便能夠對齊兩個圖像。
- 選定的圖層調整：
- 通過單擊所需的層按鈕來選擇要調整的層（默認情況下為HE）
- 單擊鼠標左移選定的圖層。
- 用鼠標右鍵單擊（或Ctrl +單擊）平移圖像。使用滾輪或縮放按鈕進行縮放。
- 選擇要在“工具”中應用的變換類型（移動或旋轉）。
- 調整將會是分層的，可以禁用/啟用它們。
- 通過“調整”工具框添加調整（不透明度，亮度，對比度等），以便能夠更好地查看參考點。
-
完成后，單擊斑點調整選項卡按鈕（選項卡和筆圖標）
圖像對齊
第三步：斑點調整
在此處，您可以刪除錯誤檢測到的斑點，手動添加未檢測到的斑點，如果分配錯誤或將多個斑點分配給同一網格（陣列）位置，則可以更改任何斑點分配。網格顯示為白色，您可以使用左下方的按鈕在HE和Cy3圖像之間切換。分配錯誤的點將帶有紅線。
最初以半透明藍色顯示檢測到的斑點。
-
導航：
- 使用Ctrl +左鍵單擊在圖像周圍移動。使用滾輪或縮放按鈕進行縮放。
- 左擊選擇斑點。多個選擇將被自動添加。
- 右鍵單擊或按“Clear selection”按鈕取消選擇斑點。
- 使用“Delete selected spots”按鈕刪除選定的斑點。
- 左鍵或右鍵單擊可移動/定位斑點。
如果已經上傳了HE圖像，則可以通過單擊“選擇組織內的斑點”按鈕來自動選擇組織邊界內的斑點。
可以通過單擊“Add Spots”按鈕并左鍵單擊應放置的位置來添加缺失的斑點。通過單擊“返回”按鈕返回選擇模式。
通過使用"Edit assignments"按鈕來更改斑點的分配。錯誤分配的斑點將帶有紅線。有時，在同一位置檢測到多個斑點，因此必須將其刪除，然后手動添加正確的斑點。有時，某個斑點的分配有誤，因此可以在“Edit assignments”菜單中通過將其拖放到正確的位置來更改其分配。
導出spot values:
- 單擊“Data export”選項卡。
- 選擇是導出所有斑點還是僅導出當前選擇。
- 選擇是否包括一個標志，該標志指示是否選擇了導出（在tissue下面）。
- 單擊“Export Spot Data”按鈕。
-
單擊“Export Alignment Matrix”按鈕。
Export the spot values
輸出數據格式
導出的數據可用制表符分隔的文件格式設置，格式如下（對于選定位置）：
x y new_x new_y pixel_x pixel_y
- x和y是原始點坐標
- new_x和new_y是相對于它們在數組中應具有的位置的數字。
- pixel_x和pixel_y是圖像上該點的像素坐標。
或者，如果您選擇包括選擇標志，則格式為：
x y new_x new_y pixel_x pixel_y selected_flag
如果僅導出選擇內容，則不存在selected_flag。在所有斑點都已導出的情況下，如果已選擇斑點，則標記為1；否則，標記為0。其他為0。
舉個例子：
對于陣列中位于（3，4）的點，其x坐標實際上位于距離x坐標為的4附近10％的位置，而其y坐標位于y坐標為3的附近5％。在圖像上，它位于像素處坐標510、780。
3 4 3.1 3.95 510 780
也可以導出包含3x3仿射變換矩陣(affine transformation matrix )的文件，該矩陣允許將數組坐標轉換為像素坐標。該矩陣可用于將數據繪制到HE圖像上。
a11 a12 a13 a21 a22 a23 a31 32 a33
每個元素對應于3x3仿射矩陣變換的一個細胞，以從數組坐標變為像素坐標
最后一步：數據轉換和可視化
所選的點（例如在組織中）的導出的調整后陣列坐標可用于調整由ST管道生成的ST數據集。
ST Pipeline軟件包的腳本“ adjust_matrix_coordinates.py” 可用于調整ST Pipeline（TSV格式的矩陣）的輸出，如下所示：
adjust_matrix_coordinates.py --coordinates-file new_array_coordinates.txt \
--outfile new_stdata.tsv --counts-matrix stdata.tsv
這將生成一個新矩陣（new_stdata.tsv），該矩陣僅包含ST點檢測器ST Spots detector的輸出中存在的點（以數組坐標表示）并具有已調整的坐標。
然后，可以使用3x3仿射矩陣文件通過ST Viewer、ST Analysis或您自己的腳本將數據繪制到組織圖像（HE）上。
