空間轉錄組測序技術追蹤-第三期
??????? 在本期內容中，我們先借助Spatial Transcriptomics公司的原產品的Protocol詳細了解一下技術的細節和要求。
??????? 空間轉錄組的大致流程為，首先，先對凍存組織進行OCT包埋，冷凍切片，取部分切片提取RNA進行質檢，RIN值>7才能夠達到后續的實驗要求。樣本RIN值合格后，即可進行后續的實驗；正式實驗中，包括組織優化Tissue Optimization（利用組織優化芯片）和正式的文庫準備Library Preparation（LP芯片）先將切片粘附在組織優化芯片上，進行固定和H&E染色和顯微鏡的明場拍照，然后進行組織優化的后續實驗步驟。組織優化流程是為了測試感興趣的組織是否與空間轉錄組技術相兼容，并在整個空間轉錄組方案中優化給定組織的實驗參數。
??????? 組織優化芯片結構如下：
??????? 組織優化芯片有6個亞區，8x8mm，每個反應區域為7.5x7.5mm，推薦用其中5個測試組織優化條件，1個用于陰性對照。陰性對照放置同樣的組織切片，用其他試劑代替透化試劑處理；但是在預透化步驟仍然會產生弱信號，不過優化好的會產生比隱性對照強很多的信號。
??????? 組織優化的流程：
??????? 組織優化用的載玻片上有6個覆蓋有RNA捕獲探針的的正方形亞區。單個組織切片放置于每個亞區內，然后對組織進行甲醛固定、H&E染色、成像。然后加入透化試劑，使RNA從組織切片中釋放出來，并與緊鄰的RNA捕獲探針雜交。設置一系列不同的透化條件能使用戶確定感興趣組織的最佳方案。隨后利用熒光標記的核苷酸進行cDNA合成。最后，為了準確檢測cDNA產生的熒光，組織必須被去除，組織去除步驟是優化的另一個關鍵點。
組織處理和切片注意事項：
?新鮮組織凍存于-80度，避免融化。
?如果凍存組織沒有用OCT包埋，那么在切片之前需要進行OCT包埋。包埋之前需要將OCT預冷，使其變硬后包埋。
?組織切片大小最大為7.5mm x 7.5mm，與組織優化芯片相匹配，但是如果計劃用相同的組織去做正式的實驗，那么組織切片不能超過6.3mm x 6.7mm。
?組織+OCT需要10mm x 10mm見方（OCT會在固定和染色過程中被溶解和沖洗掉）。
?組織用冷凍切片機切片。
?先把TO芯片在冷凍切片機中預冷。
?推薦組織切片厚度為5-16μm；
?將組織切片放置在TO芯片上，確保放在玻片有效的表面上；（仔細放置組織切片，避免觸碰到組織本身，可以觸碰周圍的OCT。將1個手指放在TO玻片的背面幾秒鐘，使玻片變暖，一旦目標區域玻片被溫熱后，組織會自動粘附到玻片上）；
?當組織切片放置在TO玻片上后，可-80度至多保存7天，或者可以直接開展實驗。
明場成像注意事項：
?明場成像系統是為了捕獲H&E染色的圖像。
?為了在合理的時間范圍內生成染色組織切片的高分辨率圖像，我們建議低放大率，高數值孔徑（NA）(e.g. 10x NA 0.45, 20x NA 0.5, 20x
?NA 0.75)，捕獲的圖像需要利用計算軟件進行整合。
熒光掃描注意事項:
?采用微陣列掃描儀（如Innosca 710）能利用532nm激光有效激發熒光，建議分辨率為10μm/pixel。
?利用標準的熒光顯微鏡也能夠捕獲信號，但是需要broad Cy3/TRITC filter。(e.g. Chroma 49004; Zeiss 43HE)，高NA物鏡(e.g. 20x NA 0.75)，以及更長的曝光時間。得到的熒光足跡就如H&E染色看到的形態，并且與背景是很容易好區分的。
組織移除注意事項：
?對于纖維少的、脂肪類的組織像腦，采用酶移除法 Proteinase K；
?對于纖維多組織，先采用化學試劑移除法β-mercaptoethanol ，再用酶移除法Proteinase K ；
*這里需要用TO實驗中摸索出的處理條件。
*如果組織移除失敗，組織還留在玻片上，那就要再做一個組織優化實驗，增加或者更長時間的組織移除步驟。如果只有部分組織殘留，你還可以試著去掃描玻片，然而，重要的是你要能區分很強的組織自身的發出的熒光型號和相對弱的cDNA足跡信號。
?該圖是測試小鼠腦10μm切片組織優化透化條件的圖。可以看到與陰性對照相比，透化會顯著增強信號。該組織6分鐘的透化處理能產生最強的cDNA熒光足跡。因此6分鐘作為透化的最佳時間。
以上就是組織優化TO的主要內容，下面我們來介紹正式文庫LP準備的方法。
?LP的玻片有6個亞區。每個亞區表面含有標簽序列陣列點能夠捕獲mRNA，同時也作為反轉錄的引物。每個點中含有上百萬個標簽序列，并且每個點有獨特的barcode，能夠區分每個點。每個陣列含有1007個這樣的點。
?組織切片放置在每個陣列上，固定，蘇木精&伊紅染色和拍照。接著，在細胞上加入透化試劑使mRNA從組織切片中釋放出來，與玻片表面的標簽雜交。然后進行cDNA合成。cDNA合成后，需要將組織從玻片表面移除（這是一個需要通過TO實驗選擇最優條件的關鍵步驟）。
?組織移除之后，表面標簽/cDNA和結合的mRNA被從玻片表面切掉。每個陣列上的標簽被搜集到不同的tube中。最后，切下來的標簽用于準備測序文庫。
??????? 推薦做5個組織切片，第6個亞區用作陽性對照。陽性對照是為了確保cDNA合成的是成功的。陽性對照不要放置組織切片，只需要用control RNA和cDNA master mix。RNA需要片段化成大約300bp。如果不想用陽性對照，也可以全部放置組織切片。
明場掃描：
熒光掃描：
??????? 熒光掃描的目的是為了準確比對H&E染色圖像與空間轉錄組數據的每個陣列中的點。實驗最后每個熒光點圖像必須獲得。這些熒光點會與明場圖片中蘇木精染色的點進行比對。
最后我們來看一下總體實驗流程：
??????? 以上就是本期的全部內容了，spatial transcriptomics被10x Genomcis公司收購后，對整個實驗流程和芯片都進行了非常大的優化，據說可以在1天內完成從獲得切片開始到文庫構建的全部流程，大大降低了實驗過程的復雜度。下期將帶大家了解優化后的芯片和實驗流程~
「2019年10月29日 ·北京」
