10X公司提供兩款空間轉錄組軟件，和單細胞對應的軟件很相似，最大區別在于增加了空間信息的可視化。那么，如何將空間信息準確定位以及如何將基因表達量準確mapping到空間信息中呢？ Space Ranger結合 Loupe Browser?給出了一套解決方案。
成像算法
Space Ranger依靠圖像處理算法來解決與玻片（slide ）圖像相關的兩個關鍵問題：
- 確定組織位置
- 校準基準點
需要組織檢測來識別哪些捕獲點，因此哪些條形碼（barcode）將用于分析。由于每個用戶在Visium捕獲區域成像時可能會因為視角不同而設置不同，數據需要基準對齊，這樣Space Ranger就可以知道圖像中單個條形碼點的位置。
由于圖像的尺度和大小是未知的，基準幀的一個未知子集可能被組織或碎片覆蓋，每個組織都有其獨特的外觀，并且圖像的曝光可能會隨著操作的不同而不同，這些問題使圖像定位變得更加困難。
如果這里描述的任何一個過程不能充分執行，用戶可以使用Loupe Browser.
的手動對齊和組織選擇向導。請注意，在大多數情況下，Space Ranger流程將無法指示發生了圖形定位方面的故障，所以鼓勵用戶檢查Space Ranger輸出的Web摘要首頁上的質量控制圖像。
最后，為了使用這里描述的自動分析，圖像必須使用左上角的“沙漏”基準來定位:
基準框架
Visium包含一個系統，用于識別打印在每張slide上的特定的不可見捕獲點模式，以及這些模式與圍繞每個捕獲區域形成框架的可見基準點之間的關系。基準框架具有軟件試圖識別的獨特的角和邊。
這個過程首先提取“看起來”像基準點的特征，然后嘗試將這些候選基準點與已知的基準點模式對齊。從圖像中提取的斑點必然會包含一些遺漏，例如在基準斑點被組織覆蓋的地方，以及一些誤報，例如在slide上的碎片或組織特征可能看起來像基準斑點的地方。
在從圖像中提取假定的基準點之后，該模式與已知的基準點模式對齊，其方式對一定數量的假陽性和假陰性具有魯棒性。這個過程的輸出是一個坐標轉換，它將Visium條形碼斑點模式與用戶的組織圖像聯系起來。
組織檢測
Visium 片中的每個區域都包含一個包含4992個捕獲點的網格，網格中填充了用于捕獲聚腺苷酸mRNA的空間條形碼探針。實際上，這些斑點只有一小部分被組織覆蓋。為了將Space Ranger的分析限制在那些放置了組織的點上，Space Ranger使用一種算法來識別輸入的brightfield圖像中的組織。
使用輸入圖像的灰度、下采樣版本，計算和比較組織切片放置的多個估計值。這些估計值用于訓練統計分類器將捕獲區域內的每個像素標記為組織還是背景。
下面的質量控制圖像顯示了這個過程的結果。確定為組織的單個圖像像素的顏色為淡藍色。不可見的捕獲點的位置在背景上用灰色圓圈表示，在組織上用深藍色圓點表示。
為了獲得最優的結果，該算法期望得到的圖像具有平滑、明亮的背景和較暗、結構復雜的組織。如果用藍色繪制的區域與組織不一致，您可以在運行Space Ranger之前在 Loupe Browser中執行手動對齊和組織選擇。有關如何改進圖像輸入以獲得更好的結果的信息，請參閱故障排除部分：troubleshooting。
借助 Loupe Browser 認為校準
Space Ranger 使用自動圖像檢測算法（ automatic image detection algorithms）來計算基準標記的位置，并找到組織的邊界。10x Genomics在各種圖像、組織和樣本上測試算法，發現檢測算法是穩健的。然而，在某些情況下，基準標記是模糊的，或者檢測到的輪廓不是組織邊界的確切位置。此外，某些組織，特別是那些有孔洞或縫隙的組織，可能需要更多的微調，以避免在下游分析中包括背景點。
Loupe Browser 4.0及以后版本為需要更多手動干預的情況提供了Visium手動對齊功能。該向導使得以交互方式將圖像對齊到slide的基準標記位置成為可能，使用一套工具執行組織選擇，并將手動對齊導出到Space Ranger運行中。本教程將逐步介紹這個過程。
輸入定位信息
Visium手動對齊向導可以在Loupe瀏覽器的開始頁面中找到，位于左下角，在Align a Visium Image下。
單擊鏈接將啟動向導。向導的第一頁顯示Visium載玻片的示意圖，包括載玻片上序列號的位置，以及載玻片上每個捕獲區域的位置。
由于點的位置在不同的載玻片和不同的捕捉區域之間會有細微的變化，為圖像提供正確的幻燈片和捕捉區域信息可以確保最準確的定位和點的位置。
接下來，單擊** Input Alignment Data **， 打開 Input Data頁面，其中包含加載圖像的提示，并輸入載玻片和捕獲區域信息。
The rest of the tutorial assumes the following resources:
- Image: Download
- Slide serial: V19L29-035
- Capture area: A1
下載的是JPG格式的圖片。
打開圖片
Visium手動對齊向導接受與Space Ranger相同類型的圖像文件，包括:
- TIFF or BigTIFF images with 8 bytes per channel, color
- TIFF for BigTIFF images with 16 bytes per channel, grayscale
- JPEG images
單擊Open Image打開一個文件對話框，對當前文件系統進行篩選，尋找兼容的圖像文件。選擇一個文件會觸發一個簡短的加載過程（這只可能發生在非常大的圖像）。如果運行向導的計算機沒有足夠的RAM來有效地加載映像，則需要確認向導才能繼續。
圖片載入后，是這樣的：
載玻片信息
輸入載玻片信息有三種選擇。
- 默認情況下，即直接輸入slide序列號和拍攝圖像的捕獲區域，是首選的機制。此選項需要連網，因為最新的slide信息是從10x下載的。(對于離線選項，請繼續閱讀。)在slide序列號文本框中輸入序列號(本教程中為V19L29-035)并按下“下載”按鈕將驗證序列號并加載slide信息。如果slide號無效，或者沒有互聯網連接，程序將顯示一個提示。捕獲區域選擇器在成功輸入后可見。選擇捕獲區域將解鎖“開Start Alignment Process”按鈕，然后執行下一步。
下載完是這樣的：
第二個選項更適合脫機模式，如果映像slide的點偏移文件在本地可用。單擊打開的slide文件提示此類文件，其中格式為slide系列。gpr，如V19L29-035.gpr。一旦文件被加載和驗證，捕獲區域選擇器是可見的。選擇捕獲區域將解鎖“Start Alignment Process”按鈕，然后執行下一步。
最后，如果圖像的序列號和捕獲區域未知或點偏移文件不可用，仍然可以使用第三個選項進行手動對齊。Visium手動對齊向導在對齊步驟中使用理想的網格布局，而不是特定于slide的點偏移文件。從理想網格到實際滑動位置的每個點的增量可能在5-15微米之間，明顯小于每個點的寬度。雖然光斑精度有所下降，但光斑與底層圖像之間的關系仍然是一致的。
將點（Spots）與圖像對齊
使用圖像中的點位置信息和上一步中加載的點偏移文件來啟用交互式手動對齊，使用基準標記作為視覺指南。這些點與圖像對齊，首先以粗粒度的方式識別基準標記的中心，然后以細粒度的方式通過拖動進行小的調整。
對齊說明位于頁面的左側，對齊工具位于右側。仔細按照說明操作是很重要的，因為每一步提示都會有細微的變化。完整的對齊說明不會在這里重復，但這里有一些成功的注意事項:
- 如果其中一個角的形狀被薄紙遮住了，最好猜一猜。帶有三個角的細粒度對齊仍然會產生令人滿意的結果。
- 如果一個角X沒有居中，先處理其余的角，然后單擊清除中心重置。
-
經過選擇和微調后，在圖像上方疊加一個紅色基準幀，基準標記對齊，如下圖所示:
識別組織
選擇精確的組織邊界可以產生高質量的數據，減少背景驅動聚類的可能性，并為微調測序參數提供準確的spot count。當從識別組織頁面開始時，在圖像的頂部繪制帶有條形碼的斑點，這些斑點的位置是從前面的對齊步驟推斷出來的，如下圖所示。
圖像左側的工具欄提供了各種工具來執行粗粒度（ coarse-grained ）和細粒度（ fine-grained）的組織選擇。下表描述了這些工具。
一個典型的組織選擇工作流程從套索工具開始。通過在組織周圍拖動套索，可以大致選擇組織對應的區域。當前選擇的斑點比未選擇的斑點顏色更深，如下圖所示。完成拖動后，將出現一個提示。選定的點可以作為組織標簽，標簽作為背景，或選擇清除選擇取消拖動（ Label as Tissue, Label as Background, or Clear Selection）。
以上選擇大致對應組織的位置，所以將其標記為組織是合適的選擇。標記為組織的斑點顯示為綠色，標記為背景的斑點保持為灰色，如下圖所示。
通過這種方式，套索工具可以用來創建大面積的組織，大面積的背景區域，或組織中的孔洞。
由于套索工具的近似性質，在組織邊界外仍可能有標記為組織的spot。使用縮放(Zoom )工具和更精確的標簽作為背景橡皮擦(Eraser )工具來細化邊界。放大兩個級別，并將橡皮擦大小調整到大約兩個點寬，為細化前面的選擇提供了良好的控制級別。
標簽作為組織刷(Brush )和標簽作為背景橡皮擦(Eraser )都有可調的大小，可以通過工具欄下方的滑塊進行配置。完成后，縮小應產生一個令人滿意的組織邊界。
返回到先前的步驟在向導進行微調，作出調整，重新啟動對齊，重新啟動組織檢測，或輸入不同的數據。一旦對齊滿意，最后一步是將對齊文件導出到Space Ranger。單擊“Identify Tissue ”步驟繼續。
導出對齊
最后一步，導出到Space Ranger，顯示完整的基準點對齊和組織選擇，如下圖所示。
這幅圖像大致反映了在Space Ranger web 摘要中顯示的對準預覽。單擊相機圖標將生成一個屏幕截圖，用于記錄對齊情況。單擊Export生成一個JSON文件，如果在輸入數據步驟中提供了該文件，則以slide 和捕獲區域命名。
該文件在spaceranger管道中用于覆蓋自動基準和組織檢測。管道操作符需要使用loupe-alignment參數運行管道，并使用生成文件的路徑。有關更多信息，請參閱e Space Ranger 文檔中的手動對準說明。
$ cd /home/jdoe/runs
$ spaceranger count --id=sample345 \
--transcriptome=/opt/refdata/GRCh38-3.0.0 \
--fastqs=/home/jdoe/runs/HAWT7ADXX/outs/fastq_path \
--sample=mysample \
--image=/home/jdoe/runs/images/sample345.tif \
--slide=V19J01-123 \
--area=A1 \
--loupe-alignment=sample345.json # 我就是 對齊文件
