2?? 雙序列比對(2)：BLAST詳細操作:web版和linux版

序列比對和序列特征分析總目錄

網址：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi
運行方式：本地或web

基本的BLAST工具包括：

圖1 BLAST

blastn:核酸搜核酸數據庫
blastp：蛋白質搜蛋白質數據庫
blastx：DNA用所有可能的閱讀框翻譯成翻譯成蛋白后搜蛋白數據庫
tblastn：查詢的蛋白序列搜索核酸數據庫中，DNA序列翻譯后的蛋白序列
tblastx：核酸序列翻譯成蛋白質后搜索核酸數據庫中的核酸序列翻譯后的蛋白質序列。也就是查詢的蛋白和數據庫中的DNA都翻譯成蛋白進行比對。


blast基本工具

一： web blast

舉一個例子說明
圖1可以看到，輸入框可以輸入accesion number，gi，或FASTA序列，也可以上傳文件。
job title給查詢的任務取個名字。

參數設置

  • Database：圖2，一般選擇nr，即非冗余蛋白序列數據庫，該庫包括GenBank CDS tranlations，RefSSeq Proteins，PDB，Swiss-Prot，PIR和PRF全體數據庫的非冗余數據
圖2 參數設置
  • 算法參數設置
    首先每個參數后面都有說明，可以詳細查看該選擇哪個
  • Organism可以限制物種
  • Expect threshold期望閾值，默認10
  • word size字長，默認3，還可以設置為10或2，數值小搜索的結果會增加，速度會變慢
  • matrix序列比對的打分矩陣，默認LOSUM62

  • Gap costs:BLAST采取線性空間罰分方式，為開放罰分和延伸罰分，默認是開放罰分值11，延伸罰分值1


    圖3 算法參數設置

結果解讀

  • 搜索詳細情況描述。圖4，查詢的分子類型，比對的數據庫，都有描述。
圖4 結果1

  • 圖形結果。查詢序列含有的保守結構域，以及數據庫中與查詢序列匹配項的圖形。不同彩色條帶顏色代表得分的高低。


    圖5 結果2

  • 詳細列表信息.與查詢的序列匹配的數據庫中的序列列表，每一個序列包括score，evalue，identity，accesion等。


    圖6 結果3

  • 查詢序列與數據庫中的匹配序列之間的雙序列比對情況。包括score，expect，identity同一性得分，positive相似性分值，gaps空位。


    圖7 結果4

總結：

web版的blast方便，快捷，容易操作，數據庫更新快。確定是不利于操作大力量數據，也不能自定義搜索的數據庫，只能對NCBI提供的數據庫進行序列相似性分析。所以

NCBI提供了本地化安裝的blast軟件包，這樣就可以構建自己的數據庫，提高同源性分析的準確性和一致性。

二： LINUX下BLAST的安裝與運行

優點：速度快，靈活性大，可自己配置庫
缺點：序列數據庫下載量大，并且更新麻煩，需要重新下載

1 安裝配置BLAST

1.1 利用conda安裝，關于conda請看之前的簡文 
#啟動環境
$ source ~/miniconda3/bin/activate
$ conda install blast

比較簡單

1.2 直接下載安裝

首先在ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/下載最新版本的BLAST程序。

wget ftp://ftp.ncbi.nlm.nih.gov/blast/executables/blast+/LATEST/ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar.gz

Connecting to ftp.ncbi.nlm.nih.gov (ftp.ncbi.nlm.nih.gov)|130.14.250.12|:21... connected.
Logging in as anonymous ... Logged in!
==> SYST ... done.    ==> PWD ... done.
==> TYPE I ... done.  ==> CWD (1) /blast/executables/LATEST ... done.
==> SIZE ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar.gz ... 241992963
==> PASV ... done.    ==> REST 173905320 ... done.
==> RETR ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar.gz ... done.
Length: 241992963 (231M), 68087643 (65M) remaining (unauthoritative)

ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar. 100%[++++++++++++++++++++++++++++++++++++++++================>] 230.78M  2.92MB/s    in 33s

2019-01-23 13:30:52 (1.98 MB/s) - ‘ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar.gz’ saved [241992963]

接下來解壓縮

$ tar -xzvf ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar.gz
$ rm ncbi-blast-2.8.1+-x64-linux.tar.gz
$ mv ncbi-blast-2.8.1+/ blast
$ cd blast
$ cd bin
$ ls

可執行文件顯示如下

blastdb_aliastool  blastn             deltablast             makeblastdb    rpsblast    tblastx
blastdbcheck       blastp             dustmasker             makembindex    rpstblastn  update_blastdb.pl
blastdbcmd         blastx             get_species_taxids.sh  makeprofiledb  segmasker   windowmasker
blast_formatter    convert2blastmask  legacy_blast.pl        psiblast       tblastn

2 運行

要進行序列比對，得有以下幾個條件

第一，有查詢序列，并有特定格式
第二，有目標序列庫，蛋白庫還是DNA庫
第三，確定查詢工具，blastn,blastp,blastx,tblastx,tblastn
第四，設定合適參數開始運行
具體用法BLAST手冊《BLAST Command Line Applications User Manual》

2.1本地建庫

第1??：NCBI下載nt和nr庫文件到本地

BLAST database

獲取blast database的最好方法是NCBI下載。
通過運行$ update_blastdb.pl --decompress nr [*]程序，可以下載預先格式化的NCBI BLAST database。

#先創建blast_db目錄
~$ mkdir blast_db
$ cd blast_db
# 耗時很長，放入后臺
$ nohup time update_blastdb.pl nt nr > log &
$ nohup time tar -zxvf *.tar.gz > log2 &

說明:nt為核酸，nr為蛋白質
監控庫文件是否下載完成，如何判斷？ 1. 查看log文件是否有提示；2. 查看update_blastdb.pl是否還在運行：執行ps -aef | grep update_blastdb.pl | grep -v update_blastdb.pl 命令，如過沒有結果，則說明沒有運行了。

這部分來自hoptop也可以是從ncbi上直接下載一系列nt/nr.xx.tar.gz文件，然后解壓縮即可，后續可以用update_blastdb.pl進行數據更新。
報錯： 使用update_blastdb.pl更新和下載數據庫時候出現模塊未安裝的問題。解決方法，首先用conda安裝對應的模塊，然后修改update_blastdb.pl的第一行，即shebang部分，以conda的perl替換，或者按照如下方法執行。
perl which update_blastdb.pl
下載過程中請確保網絡狀態良好，否則會出現Downloading nt.00.tar.gz...Unable to close datastream報錯。

第2??：用自己的序列建庫makeblastdb

BLAST需要進行序列數據的索引格式化，然后才可以進行序列的比對搜索，所以先用makeblastdb進行格式化

makeblastdb -in mydb.fasta -dbtype nucl -parse_seqids -out dbname

簡單解釋如下：
-in :表示輸入的數據文件
-dbtype:序列數據類型，核酸nucl，蛋白質prot

詳細用法：
$ makeblastdb -help
USAGE
  makeblastdb [-h] [-help] [-in input_file] [-input_type type]
    -dbtype molecule_type [-title database_title] [-parse_seqids]
    [-hash_index] [-mask_data mask_data_files] [-mask_id mask_algo_ids]
    [-mask_desc mask_algo_descriptions] [-gi_mask]
    [-gi_mask_name gi_based_mask_names] [-out database_name]
    [-max_file_sz number_of_bytes] [-logfile File_Name] [-taxid TaxID]
    [-taxid_map TaxIDMapFile] [-version]

DESCRIPTION
   Application to create BLAST databases, version 2.7.1+

REQUIRED ARGUMENTS
 -dbtype <String, `nucl', `prot'>
   Molecule type of target db

OPTIONAL ARGUMENTS
 -h
   Print USAGE and DESCRIPTION;  ignore all other parameters
 -help
   Print USAGE, DESCRIPTION and ARGUMENTS; ignore all other parameters
 -version
   Print version number;  ignore other arguments

 *** Input options
 -in <File_In>
   Input file/database name
   Default = `-'
 -input_type <String, `asn1_bin', `asn1_txt', `blastdb', `fasta'>
   Type of the data specified in input_file
   Default = `fasta'

 *** Configuration options
 -title <String>
   Title for BLAST database
   Default = input file name provided to -in argument

所需的基因組文件可以下載，也可以是自己測序的。現在我用我自己的文件mybp.fa,看如何建庫

$ makeblastdb -in mybp.fa -dbtype nucl -out mybp -parse_seqids

顯示如下，建庫完成

Building a new DB, current time: 01/24/2019 07:55:54
New DB name:   /mnt/d/yinlibioinfor/mybp
New DB title:  mybp.fa
Sequence type: Nucleotide
Keep MBits: T
Maximum file size: 1000000000B
Adding sequences from FASTA; added 2 sequences in 0.0724082 seconds.

本地目標文件夾會產生以下幾個數據庫文件


mybp

2.2：運行

最基本的BLAST命令包含query和db參數

blastn -db mydb.fa -query xx.fa -out results.out
  • query: 檢索文件
  • remote：上面已經把nt nr下載到本地，如果不下載可以加 -remote，速度會慢
    -evalue，默認10，設置輸出結果的e-value。如果E小于10-5，說明兩條序列有較高同源性，統計學意義顯著。若小于10-6則表示同源性非常高。幾乎可以百分百確定。

A:用我自己的一段序列查詢

$ blastn -db mybp -query query.fa

結果如下：

Database: mybp.fa
           2 sequences; 7,163,595 total letters



Query= query

Length=366
                                                                      Score     E
Sequences producing significant alignments:                          (Bits)  Value

Chromosome2  circular                                                 676     0.0


>Chromosome2 circular
Length=3363129

 Score = 676 bits (366),  Expect = 0.0
 Identities = 366/366 (100%), Gaps = 0/366 (0%)
 Strand=Plus/Plus

Query  1        ATGATCAAGGACGTTCTACGACTTAAATTCGACGGCAGCCTTTCGCACGATCGGATCGCC  60
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1167368  ATGATCAAGGACGTTCTACGACTTAAATTCGACGGCAGCCTTTCGCACGATCGGATCGCC  1167427

Query  61       ACGTCGCTGGGCATTTCCAAAAGCGTGGTCACGAAGCACGTCGGACCGGCGGGCGCCGCC  120
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1167428  ACGTCGCTGGGCATTTCCAAAAGCGTGGTCACGAAGCACGTCGGACCGGCGGGCGCCGCC  1167487

Query  121      GGGCTGGACCGGGCAAGCACCTGCGAGATGGACGAGGGCGAGCGCAAGCGGCGGCTACTC  180
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1167488  GGGCTGGACCGGGCAAGCACCTGCGAGATGGACGAGGGCGAGCGCAAGCGGCGGCTACTC  1167547

Query  181      GGCAAGCCCATGAGACCAGCGACCTACGTCCAGCCCGATTACGGGCGCATCCATCAGGAA  240
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1167548  GGCAAGCCCATGAGACCAGCGACCTACGTCCAGCCCGATTACGGGCGCATCCATCAGGAA  1167607

Query  241      CTGCGCCGCAAAGGCGTGACGTTGACGCTGCTGTGGGAGGAGTACCAAGTCGAGTTCGCC  300
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1167608  CTGCGCCGCAAAGGCGTGACGTTGACGCTGCTGTGGGAGGAGTACCAAGTCGAGTTCGCC  1167667

Query  301      GGCCGGCAAACCTACCGCTCTACGCGCAATTCTGCGAGCACTACAAGGCGTTCACAAAGC  360
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  1167668  GGCCGGCAAACCTACCGCTCTACGCGCAATTCTGCGAGCACTACAAGGCGTTCACAAAGC  1167727

Query  361      GTCTGA  366
                ||||||
Sbjct  1167728  GTCTGA  1167733

query序列本身就是來自上述基因組，所以完全匹配。

B:使用遠程服務器在線比對,但是速度真的是很慢

$ blastn -db nr -remote -query query.fa

小部分結果如下

Database: Nucleotide collection (nt)
           49,985,097 sequences; 191,944,857,236 total letters



Query= query

Length=366

RID: 4J1C2RW4015
                                                                      Score     E
Sequences producing significant alignments:                          (Bits)  Value

CP033704.1  Burkholderia pseudomallei strain FDAARGOS_593 chromos...  676     0.0
CP033701.1  Burkholderia pseudomallei strain FDAARGOS_594 chromos...  676     0.0
CP025307.1  Burkholderia pseudomallei strain D286 chromosome 2, c...  676     0.0
CP025305.1  Burkholderia pseudomallei strain R15 chromosome R15.2...  676     0.0
CP025303.1  Burkholderia pseudomallei strain PMC2000 chromosome P...  676     0.0
CP025301.1  Burkholderia pseudomallei strain H10 chromosome H10.2     676     0.0
CP019043.1  Burkholderia pseudomallei strain 14M0960418 chromosom...  676     0.0
CP012577.1  Burkholderia pseudomallei strain 982 chromosome 2, co...  676     0.0
CP012093.1  Burkholderia pseudomallei strain 350105 chromosome 2 ...  676     0.0
CP009297.1  Burkholderia pseudomallei 406e chromosome 2, complete...  676     0.0
CP004380.1  Burkholderia pseudomallei 1026b chromosome 2, complet...  676     0.0
CP010974.1  Burkholderia pseudomallei strain vgh07 chromosome 2, ...  676     0.0
CP009127.1  Burkholderia pseudomallei strain BSR chromosome 2, co...  676     0.0
CP008893.1  Burkholderia pseudomallei HBPUB10303a chromosome 2, c...  676     0.0
CP008912.1  Burkholderia pseudomallei HBPUB10134a chromosome 2, c...  676     0.0
CP008891.1  Burkholderia pseudomallei MSHR5858 chromosome 2, comp...  676     0.0
CP008835.1  Burkholderia pseudomallei strain BGR chromosome 2, co...  676     0.0
CP008782.1  Burkholderia pseudomallei strain Mahidol-1106a chromo...  676     0.0
CP008759.1  Burkholderia pseudomallei strain 1106a chromosome 2, ...  676     0.0
CP008754.1  Burkholderia pseudomallei strain 9 chromosome 2, comp...  676     0.0
CP004002.1  Burkholderia pseudomallei NCTC 13178 chromosome 2, co...  676     0.0
CP003782.1  Burkholderia pseudomallei BPC006 chromosome II, compl...  676     0.0
CP002834.1  Burkholderia pseudomallei 1026b chromosome 2, complet...  676     0.0
CP000573.1  Burkholderia pseudomallei 1106a chromosome II, comple...  676     0.0
CP009163.1  Burkholderia pseudomallei K42 chromosome 2, complete ...  665     0.0
CP016912.1  Burkholderia pseudomallei strain Burk178-Type2 chromo...  660     0.0
CP016910.1  Burkholderia pseudomallei strain Burk178-Type1 chromo...  660     0.0
CP009160.1  Burkholderia pseudomallei TSV 48 chromosome 2, comple...  660     0.0
CP009152.1  Burkholderia pseudomallei MSHR3965 chromosome 2, comp...  660     0.0
CP008910.1  Burkholderia pseudomallei MSHR5848 chromosome 2, comp...  660     0.0
CP008783.1  Burkholderia pseudomallei MSHR5855 chromosome 2, comp...  660     0.0
CP008778.1  Burkholderia pseudomallei 576 chromosome 2, complete ...  660     0.0
CP009550.1  Burkholderia pseudomallei PB08298010 chromosome II, c...  654     0.0
CP025265.1  Burkholderia pseudomallei strain MSHR1435 chromosome ...  649     0.0
CP018412.1  Burkholderia pseudomallei strain 3000015486 chromosom...  649     0.0
CP018411.1  Burkholderia pseudomallei strain 3000015237 chromosom...  649     0.0
CP018409.1  Burkholderia pseudomallei strain 2013833057 chromosom...  649     0.0
CP018407.1  Burkholderia pseudomallei strain 2013833055 chromosom...  649     0.0
CP018398.1  Burkholderia pseudomallei strain 2013746777 chromosom...  649     0.0
CP018397.1  Burkholderia pseudomallei strain 2013746776 chromosom...  649     0.0
CP018394.1  Burkholderia pseudomallei strain 2011756296 chromosom...  649     0.0
CP018392.1  Burkholderia pseudomallei strain 2011756295 chromosom...  649     0.0
CP018388.1  Burkholderia pseudomallei strain 2010007509 chromosom...  649     0.0
CP018386.1  Burkholderia pseudomallei strain 2008724860 chromosom...  649     0.0
CP018419.1  Burkholderia pseudomallei strain 2002734728 chromosom...  649     0.0
CP018371.1  Burkholderia pseudomallei strain 2002721171 chromosom...  649     0.0
CP018370.1  Burkholderia pseudomallei strain 2002721123 chromosom...  649     0.0
CP018367.1  Burkholderia pseudomallei strain 2002721100 chromosome 2  649     0.0
CP017053.1  Burkholderia pseudomallei strain MSHR3763 chromosome ...  649     0.0
CP017051.1  Burkholderia pseudomallei strain MSHR4083 chromosome ...  649     0.0
CP009484.1  Burkholderia pseudomallei MSHR491 chromosome II, comp...  649     0.0
CP009156.1  Burkholderia pseudomallei strain TSV202 chromosome 2,...  649     0.0
CP009234.1  Burkholderia pseudomallei MSHR62 chromosome 2, comple...  649     0.0
CP009269.1  Burkholderia pseudomallei MSHR2243 chromosome 2 sequence  649     0.0
CP009210.1  Burkholderia pseudomallei strain BDP chromosome 2, co...  649     0.0
CP008763.1  Burkholderia pseudomallei strain MSHR346 chromosome 2...  649     0.0
CP008779.1  Burkholderia pseudomallei strain MSHR1655 chromosome ...  649     0.0
CP004369.1  Burkholderia pseudomallei MSHR520 chromosome 2, compl...  649     0.0
CP004043.1  Burkholderia pseudomallei MSHR146 chromosome 2, compl...  649     0.0
CP004024.1  Burkholderia pseudomallei MSHR511 chromosome 2, compl...  649     0.0
CP004004.1  Burkholderia pseudomallei NAU20B-16 chromosome 2, com...  649     0.0
CP006469.1  Burkholderia pseudomallei MSHR305 chromosome 2, compl...  649     0.0
CP009898.1  Burkholderia pseudomallei Pasteur 52237 chromosome 2,...  647     0.0
CP009586.1  Burkholderia pseudomallei strain PHLS 112 chromosome ...  647     0.0
CP008917.1  Burkholderia pseudomallei strain BGK chromosome 2         647     0.0
CP000125.1  Burkholderia pseudomallei 1710b chromosome II, comple...  647     0.0
CP009477.1  Burkholderia pseudomallei MSHR2543 chromosome II, com...  643     1e-180
CP022216.1  Burkholderia thailandensis strain FDAARGOS_242 chromo...  525     4e-145
CP022215.1  Burkholderia thailandensis strain FDAARGOS_241 chromo...  525     4e-145
CP020389.1  Burkholderia thailandensis strain FDAARGOS_237 chromo...  525     4e-145
CP013408.1  Burkholderia thailandensis strain MSMB59 chromosome 2...  525     4e-145
CP009602.1  Burkholderia thailandensis 2002721643 chromosome II, ...  525     4e-145
CP004382.1  Burkholderia thailandensis E254 chromosome 2, complet...  525     4e-145
CP004386.1  Burkholderia thailandensis MSMB59 chromosome 2, compl...  525     4e-145
CP008785.1  Burkholderia thailandensis E264 chromosome 1, complet...  525     4e-145
CP004384.1  Burkholderia thailandensis USAMRU Malaysia #20 chromo...  525     4e-145
CP004118.1  Burkholderia thailandensis E444 chromosome 2, complet...  525     4e-145
CP004098.1  Burkholderia thailandensis 2002721723 chromosome 2, c...  525     4e-145
CP000085.1  Burkholderia thailandensis E264 chromosome II, comple...  525     4e-145
CP013413.1  Burkholderia thailandensis strain 2002721643 chromoso...  499     2e-137
CP010018.1  Burkholderia thailandensis 34 chromosome 2, complete ...  499     2e-137


>CP033704.1 Burkholderia pseudomallei strain FDAARGOS_593 chromosome 2, complete
sequence
Length=3157202

 Score = 676 bits (366),  Expect = 0.0
 Identities = 366/366 (100%), Gaps = 0/366 (0%)
 Strand=Plus/Plus

Query  1        ATGATCAAGGACGTTCTACGACTTAAATTCGACGGCAGCCTTTCGCACGATCGGATCGCC  60
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2603781  ATGATCAAGGACGTTCTACGACTTAAATTCGACGGCAGCCTTTCGCACGATCGGATCGCC  2603840

Query  61       ACGTCGCTGGGCATTTCCAAAAGCGTGGTCACGAAGCACGTCGGACCGGCGGGCGCCGCC  120
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2603841  ACGTCGCTGGGCATTTCCAAAAGCGTGGTCACGAAGCACGTCGGACCGGCGGGCGCCGCC  2603900

Query  121      GGGCTGGACCGGGCAAGCACCTGCGAGATGGACGAGGGCGAGCGCAAGCGGCGGCTACTC  180
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2603901  GGGCTGGACCGGGCAAGCACCTGCGAGATGGACGAGGGCGAGCGCAAGCGGCGGCTACTC  2603960

Query  181      GGCAAGCCCATGAGACCAGCGACCTACGTCCAGCCCGATTACGGGCGCATCCATCAGGAA  240
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2603961  GGCAAGCCCATGAGACCAGCGACCTACGTCCAGCCCGATTACGGGCGCATCCATCAGGAA  2604020

Query  241      CTGCGCCGCAAAGGCGTGACGTTGACGCTGCTGTGGGAGGAGTACCAAGTCGAGTTCGCC  300
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2604021  CTGCGCCGCAAAGGCGTGACGTTGACGCTGCTGTGGGAGGAGTACCAAGTCGAGTTCGCC  2604080

Query  301      GGCCGGCAAACCTACCGCTCTACGCGCAATTCTGCGAGCACTACAAGGCGTTCACAAAGC  360
                ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct  2604081  GGCCGGCAAACCTACCGCTCTACGCGCAATTCTGCGAGCACTACAAGGCGTTCACAAAGC  2604140

Query  361      GTCTGA  366
                ||||||
Sbjct  2604141  GTCTGA  2604146

outform格式

 -outfmt <String>
   alignment view options:
     0 = Pairwise,
     1 = Query-anchored showing identities,
     2 = Query-anchored no identities,
     3 = Flat query-anchored showing identities,
     4 = Flat query-anchored no identities,
     5 = BLAST XML,
     6 = Tabular,
     7 = Tabular with comment lines,
     8 = Seqalign (Text ASN.1),
     9 = Seqalign (Binary ASN.1),
    10 = Comma-separated values,
    11 = BLAST archive (ASN.1),
    12 = Seqalign (JSON),
    13 = Multiple-file BLAST JSON,
    14 = Multiple-file BLAST XML2,
    15 = Single-file BLAST JSON,
    16 = Single-file BLAST XML2,
    17 = Sequence Alignment/Map (SAM),
    18 = Organism Report

像上面那個如果要輸出文件
可以

$ blastn -db mybp -query query.fa -outfmt 7 -out query.txt
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