昨天元宵，就算是把年過完了，我們又要開始一年的奔波了，有的時候我真的想問一句，去年過的并不算很好，能不能退我一歲？??，莫泊桑曾說過，生活不可能像你想得那么好，但也不會像你想的那么遭~~~，這一篇分享的文獻在Subclonal evolution and expansion of spatially distinct THY1-positive cells is associated with recurrence in glioblastoma，我們來看看膠質母細胞瘤復發的空間克隆研究。
文章思路
研究目的
膠質母細胞瘤（GBM）是一種以不可避免的復發為特征的致命疾病。 在這里，研究了介導耐藥性的分子途徑，目的是確定針對這種腫瘤的治療機會。
實驗設計
開發了一種縱向體內復發模型，利用患者衍生的外植體在替莫唑胺 (TMZ) 和放射 (IR) 后產生配對標本（復發前和復發后）。 評估這些樣本的治療反應并確定驅動治療抗性的基因表達途徑。 使用 GBM 的空間轉錄組學對研究結果進行了臨床驗證（空間轉錄組已經開始做臨床驗證了）。
研究成果
These studies reveal in replicate cohorts, a gene expression profile characterized by upregulation of mesenchymal and stem-like genes at recurrence。對臨床數據庫的分析顯示，這種轉錄譜的表達增加與中位總生存期較差（248 天 vs 430 天，p=0.0004）顯著相關，并且復發時該譜的上調。最值得注意的是，發現了 TGFβ 信號的上調，以及復發時 THY1 水平增加了一百多倍。利用細胞分選，觀察到 THY1 陽性細胞在初治腫瘤中占不到 10% 的細胞，在復發性腫瘤中占 75-96%。然后，從未接受過治療的患者樣本中分離出 THY1 陽性細胞，并確定它們在原位模型中對放化療具有固有的抵抗力。此外，使用來自未經治療的 GBM 的圖像引導活檢，進行了空間轉錄組分析。空間轉錄組揭示了以間充質/干細胞樣基因表達為特征的罕見 THY1+ 區域，類似于復發性小鼠模型樣本，其與血管周圍生態位內的巨噬細胞共定位。由于 TGFβ 信號傳導有助于間充質/干細胞樣表型，在體內抑制 TGFβ RI 活性，導致間充質/干細胞樣蛋白水平降低，包括 THY1，并恢復復發性腫瘤對 TMZ/IR 的敏感性。
結論
這些發現表明，GBM 復發可能是由于血管周圍生態位內預先存在的、治療抗性的、THY1 陽性、間充質/干細胞樣細胞的腫瘤再增殖引起的。 此外，數據證明了靶向抗性亞克隆中上調途徑作為實現治療反應的新機制的前景，特別是 THY1 表達可能代表對 TGFβ 抑制反應的生物標志物。
詳細看看全文，這一篇主要是運用空間轉錄組進行臨床驗證，非常棒，如果空間轉錄組走向臨床，前景非常廣闊
INTRODUCTION
膠質母細胞瘤 (GBM) 是最常見的原發性腦實質內腫瘤，是一種中位生存期為 15 個月的致命疾病，其特點是治療抵抗、侵襲性腦部侵襲和不可避免的復發，不到 10% 的患者存活超過 5 年.導致快速復發和缺乏有效治療的主要障礙是 GBM 明顯的腫瘤內和腫瘤間異質性。此外，鑒于 GBM 中存在的異質性，人們假設先前存在的抗治療亞克隆的進化和擴展通常是不可避免的復發的原因。在細胞和微環境水平上都可以看到瘤內異質性。在腫瘤微環境水平上，不同的生態位，尤其是血管周圍、缺氧和侵襲性腫瘤生態位，已被證明富含抗治療癌癥干細胞 (CSC) 群，也被描述為復發啟動干細胞。這些預先存在的 CSC 群體被認為在驅動治療耐藥性方面發揮著關鍵作用，其特點是自我更新、分化以及治療后擴大和重新填充腫瘤的能力。缺乏關于預先存在的抗治療癌癥干細胞在逃避化學放射治療中的作用以及這種表型的機制基礎的確切證據。了解治療耐藥表型的遺傳基礎應該為治療干預提供機會，以降低 GBM 的復發率。
在這項工作中，利用了使用源自患者的 GBM 外植體開發的縱向小鼠模型來概括臨床治療范例。使用該模型，從每只實驗小鼠中生成了預處理和復發配對樣本，目的是識別差異表達的基因，這些基因應該為腫瘤復發提供分子基礎。對多個重復顱內患者衍生異種移植物 (PDX) 的系統分析顯示，復發性腫瘤的特征在于具有間充質和 CSC 特征的基因表達模式特征，其中包括 THY1/CD90、TGFβ1、TGFβ2、SOX2、ZEB2 和 GLI2 的上調.與之前的觀察結果一致，使用大型 GBM 隊列證明該基因表達譜與較差的總體預后相關，突出了研究結果的臨床意義。為了檢驗腫瘤復發可能歸因于以該基因表達特征為特征的預先存在的細胞群的假設，對來自未接受治療的患者樣本的 THY1+ 細胞進行免疫分選，并證明顱內腫瘤來源于 THY1+ 細胞（Pre-THY1+）與未分類的腫瘤相比，它們具有固有的治療抗性。這些結果表明，在最初的初治腫瘤中可以發現具有不同基因表達譜的罕見的固有治療抗性細胞群，并導致腫瘤復發。作為支持，用逆轉間充質基因表達特征的靶向藥物治療腫瘤，導致對放化療的敏感性恢復。此外，human GBM 標本的空間轉錄組分析一致地確定了 THY1+ 細胞與間充質、膠質瘤干細胞和巨噬細胞基因特征的表達共定位，并且主要在血管周圍的生態位中發現。這表明這些罕見的耐藥細胞在血管腫瘤微環境中的重要作用。
Spatial transcriptomics的分析
獲得的人體樣本立即在液氮/異戊烷中冷凍，然后將它們嵌入最佳切割溫度的化合物中并冷凍。將組織切片到 Visium Spatial Gene Expression Slide (10X Genomics) 上并透化以釋放 mRNA 以與空間條形碼捕獲探針結合。這用于合成 cDNA，然后制備測序文庫和測序。使用 Vslide (v1.1.115, MetaSystems GmbH) 對測序數據進行可視化并將生成的圖像放在一起。使用 10X genomics軟件（Space Ranger 和 Loupe Browser）對樣本數據進行成像和分析。使用 Load10x_Spatial 函數將 SpaceRanger 輸出文件導入 R。使用 SCTransform 函數對這些點進行庫大小標準化，控制在每個點表達的線粒體基因的百分比。在使用 PCA 和 UMAP 進行降維之前，使用 MAGIC 估算基因計數以平滑數據。具體來說，主成分是使用插補后的top變量基因計算的，前 30 個主成分的數據嵌入用于識別集群和學習 UMAP 嵌入。通過從 MSigDb 以及其他數據集中整理感興趣的特定基因集，準備了基因集集合對象。富集分數是根據 MAGIC 估算的計數數據計算的?；谄骄磉_將所有基因分組到30個bin中。在每個給定的基因組中，每個基因的平均表達與來自相應bin的一百個其他隨機采樣基因作為靶基因一起計算。在每個點計算感興趣的靶基因與對照基因的平均表達差異，以計算富集分數。在計算每個點的基因集的富集分數后，生成了通路分數與 THY1 表達的散點圖，并計算了控制 G1.S 細胞周期分數的兩者之間的 Spearman 偏相關性，以解釋細胞的變化整個組織切片的活力。為了確定 THY1 表達和通路活性之間的空間重疊，對每個點進行了區域 Fisher 精確檢驗。基于 THY1 表達和通路評分，將數據二值化為第 75 個分位數的 THY1 陽性和通路陽性。然后，檢查了每個點的 k=25 最近鄰，并進行了 Fisher 精確檢驗以確定這兩個特征是否存在顯著重疊，即，pathway scores是否恰好在 THY1 陽性區域特別豐富。然后將 Fisher 檢驗 p 值疊加到組織切片上的每個spot上，以可視化在兩個特征中具有顯著重疊的區域。
RESULTS
in vivo modeling recapitulates therapeutic response to TMZ/IR followed by recurrence
為了評估 GBM 中對標準護理治療 (TMZ/IR) 的治療反應和潛在遺傳基礎，在顱內異種移植物中使用了患者來源的外植體。每周進行磁共振成像以監測植入后的腫瘤生長情況。攜帶約 20mm3 腫瘤的小鼠被隨機分為三個研究組。第一個代表未經治療的對照動物，第二個隊列同時用 TMZ/IR 治療兩周。第三組同時給予 TMZ/IR 2 周，然后每周 3 次輔助 TMZ，在完成第二周 TMZ/IR 后每隔一周。該實驗設計旨在研究對標準護理療法的抵抗機制。與腫瘤體積增加超過 300% 并在第三周死于疾病的對照動物相比，TMZ/IR 治療的動物表現出最初的腫瘤消退并存活超過六周。接受 TMZ 佐劑的小鼠表現出更大的腫瘤生長延遲，并且存活時間延長（>12 周）。盡管對治療有初步反應，但所有接受治療的動物都有復發.
為了更好地了解治療耐藥性發展的潛在遺傳基礎，在開始治療之前，使用 MRI 引導的立體定向顱內活檢從動物身上獲取腫瘤組織。 這種活檢程序不會顯著影響大體腫瘤結構。 在復發時也從這些動物獲得活的腫瘤組織。 收集配對的預處理和復發腫瘤樣本用于進一步分析。
Recurrent tumors are distinctly resistant to TMZ/IR
為了評估復發性腫瘤對治療的敏感性，將來自治療前和復發性活檢的配對神經球培養物經顱內和皮下植入免疫缺陷小鼠。將具有可觸及腫瘤的皮下植入小鼠模型隨機分為對照組或用 TMZ/IR 治療兩周，然后如上所述輔助 TMZ。在沒有治療的情況下，通過活檢獲得的治療前和復發性腫瘤都以相似的速度生長。作為對 TMZ/IR 的響應，治療前的腫瘤表現出顯著的腫瘤生長延遲（類似于最初的患者來源的腫瘤），并且腫瘤體積減少了 50%。然而，來自復發性活檢的腫瘤繼續表現出對 TMZ/IR 的耐藥性，并且腫瘤體積增加了 750%。為了在適當的腫瘤微環境中確認這些發現，使用相同的配對神經球建立顱內腫瘤。與來自治療前樣本的小鼠相比，用 TMZ/IR 加輔助 TMZ 治療患有顱內復發性腫瘤的小鼠證明了它們對治療的抵抗力。作為支持，攜帶復發性腫瘤的小鼠的中位生存期為 7 周，而未經治療的腫瘤為 11.9 周（p=0.006）
Recurrent tumors develop a therapeutic resistant phenotype with increased mesenchymal and stem cell gene expression patterns and THY1 upregulation（復發性腫瘤發展為具有增加的間充質和干細胞基因表達模式以及 THY1 上調的治療抗性表型 ）
為了描述在復發樣本中觀察到的治療抗性的潛在基因組基礎，使用 RNAseq 對來自同一主題動物的治療前和復發活檢的至少三個獨立重復進行了轉錄組分析。 發現1159個基因存在差異表達（FDR<0.05）。 在這些差異表達基因中，645 個基因在復發性腫瘤樣本中上調，而 514 個基因下調。 無監督聚類分析顯示在多個重復中預處理和復發腫瘤的不同轉錄組學特征。 此外，每個治療前樣本的轉錄組與原始患者衍生的神經球培養物的轉錄組非常相似，這表明基因表達譜在體外擴增或顱內植入后沒有drift significantly。
接下來，使用用于注釋、可視化和集成發現的數據庫 (DAVID) 進行了基因GO分析，以識別富含 TMZ/IR 抗性腫瘤的細胞過程。 復發性腫瘤顯示出改變的生物學過程，如 20 個上調和 13 個下調的功能clusters（FDR<0.05）。 這些clusters被進一步合并以產生一組非冗余的 10 個上調基因clusters和 7 個下調基因clusters。 在七個下調的clusters中，六個與細胞凋亡和細胞死亡有關。 參與細胞粘附、神經元分化/發育和細胞形態發生的基因在上調的clusters中占主導地位。 特別地，復發性腫瘤過表達與細胞粘附相關的基因（例如 ITGB3、ITGB5、ITGB8、NEDD9、FBLN7、NLGN2、CADM1 和 VCAN）以及與間充質表型相關的基因（TGFΒ2、TGFΒ1、THY1)。
發現該基因表達特征的上調與治療抗性表型相關，如臨床數據庫中較差的預后所示?；?strong>前 64 個細胞粘附基因的平均基因表達水平創建meta基因評分。從 TCGA 數據庫中選擇接受 TMZ 和 IR 治療的 GBM 患者，并根據 metagene 評分對他們進行排名。比較了 metagene 評分高的患者（所選患者總數的 1/3 以上）和 metagene 評分低的患者（所選患者總數的 1/3 以下）的無進展生存期和總生存期。如下圖所示，具有高 metagene 評分的患者的臨床結果較差，無論是在中位無進展生存期（260 天與 189 天相比，p=0.0003）還是中位總生存期（中位生存期為 430 天與248 天，p = 0.0004)。該分析證實了從實驗小鼠模型中的觀察結果，即實驗觀察到的特征的增加與患者的治療抗性相關。
為了探索與細胞粘附、間充質和干細胞表型相關的基因在 TMZ/IR 抗性中的作用，我們首先驗證了從 RNAseq 分析中選擇的基因（ZEB2、VCAN、CDK6、THY1、GLI2、SOX2），這些基因以前與治療相關 GBM 中的耐藥性。 定量 PCR 分析證實 ZEB2、VCAN、CDK6、THY1、GLI2 和 SOX2 mRNA 水平在所有四個復發性腫瘤樣本中與未接受治療的對應物相比上調。 蛋白質印跡分析證實，與未處理的對應物相比，大多數復發樣本中每個基因的蛋白質水平也有所增加。 CD133 細胞表面表位（膠質瘤干性的標志物）的表達在四種復發性腫瘤中的三種中也顯著升高。
與在重復復發腫瘤之間觀察到的基因表達的這些一致變化相反，對每個預處理和復發樣本之間的拷貝數增加或拷貝數丟失的分析沒有顯示任何顯著和一致的變化。這表明耐藥性的發展表型是由基因表達變化而不是基因組變化引起的，突出了調節已確定的相關細胞信號通路的重要性。
Inhibition of TGFβ signaling decreases THY1 expression, reverses the mesenchymal resistance phenotype, and results in improved treatment sensitivity in vivo
在復發性腫瘤中，耐藥表型的特征是間充質和 CSC 基因的表達增加。具體而言，TGFβ途徑也顯著上調。事實上，復發性腫瘤中的許多（63 個中的 21 個）上調基因與 TGFβ 信號通路直接或間接相關。 TGFβ被認為是上皮間質轉化的主要調節因子。為了評估 TGFβ 信號傳導與上調基因表達譜和 TMZ/IR 抗性的關聯，使用了 TGFβR1 絲氨酸蘇氨酸激酶抑制劑。患有來自預處理 (P2) 和復發性腫瘤 (R1) 的側腹腫瘤的動物被隨機分為四組：1) 對照組（未治療），2) TMZ/IR 治療，3) 單獨使用 TGFβ 抑制劑治療 (LY2109761) , 和 4) 用 TMZ/IR 和 LY2109761 的組合治療。未經處理的腫瘤樣本（P2 和 R1）以及經處理的復發性腫瘤樣本（RT1-5）的蛋白質印跡分析顯示，與未經處理的腫瘤相比，用 LY2109761 治療腫瘤導致 THY1、ZEB2、CDK6、SOX2 和 GLI2 的水平降低復發性腫瘤。此外，這些間充質/干表型標志物在接受 TMZ/IR 和同時接受 LY2109761 的腫瘤中也下調。這些發現表明 LY2109761 適當地靶向了GBM 模型中預期的感興趣的途徑。
LY2109761 單藥治療并未顯著減緩腫瘤生長。 然而，與單藥 LY2109761 或 TMZ/IR 治療相比，將 LY2109761 與 TMZ/IR 聯合使用可顯著降低腫瘤生長。 這些發現表明 TGFβ 介導的間充質和干細胞樣基因表達譜激活促進了對 TMZ/IR 的抗性，并且 TGFβ 抑制下調間充質和干細胞樣表型恢復對 TMZ/IR 的敏感性。
Rare THY1+ cell populations derived from treatment naive GBM are inherently TMZ/IR resistant, and repopulate the recurrent tumors
上述發現 THY1 轉錄物和蛋白質水平在復發腫瘤樣本中上調（與未治療樣本相比超過 100 倍），結合觀察到 LY2109761 治療導致 THY1 表達降低并恢復復發腫瘤對TMZ/IR，促使進一步研究 THY1。在人類癌癥中，THY1 與預后不良有關，與癌癥干細胞有關，并在粘附、侵襲、轉移、免疫逃避和上皮間質轉化中發揮作用。鑒于 THY1 表達與治療抗性和間充質特征的關聯、其在復發性腫瘤樣本中的顯著上調以及其作為細胞表面標志物的地位，定量評估了 THY1+ 細胞在腫瘤中的存在。在未經治療的腫瘤活檢中，觀察到 THY1+ 細胞占比 6-10%。相比之下，復發性腫瘤中 75-96% 的細胞是 THY1+。 FACS 從預處理樣品 (Pre-THY1+) 中分離和擴增 THY1+ 細胞，證實它們保留了細胞表面 THY1 的表達。然后將 Pre-THY1+ 細胞顱內植入裸鼠并用 TMZ/IR 處理。這些實驗表明，Pre-THY1+ 細胞實際上在一定程度上具有與復發性腫瘤相似的固有治療抗性。此外，攜帶使用 Pre-THY1+ 細胞衍生的顱內腫瘤的小鼠的存活率與攜帶源自復發細胞的腫瘤的小鼠相似。This finding, combined with the consistent observation that each of the recurrent tumors (R1-R4) exhibited an enrichment of THY1+ cells when compared to their respective pre-treatment biopsy (P1-P3) suggests that THY1+ cells represented a treatment recalcitrant cell population within the treatment-na?ve tumors. These cells have stem cell like features with a mesenchymal phenotype, and likely survive therapeutic intervention and repopulate the tumor.
為了評估上調的 THY1 的臨床意義及其與治療抗性的關聯，分析了來自 GLASS 聯盟和其他臨床數據庫的配對人類 GBM 標本，這些標本顯示 THY1 基因表達在大多數復發性腫瘤中顯著上調。 對 TCGA 數據庫的分析表明，高 THY1 表達與顯著更差的無進展生存期和總生存期相關。 這些發現表明我們的模型與臨床情況相似，并進一步強調了 THY1 在 TMZ/IR 抗性發展中的作用，并表明表達 THY1 的 GBM 細胞的克隆擴增可能有助于 TMZ/IR 抗性。
THY1 expression in human GBM is spatial niche-dependent
體內研究表明 THY1 表達與治療耐藥性和干細胞和間充質基因表達特征相關，結合最近的研究表明 THY1+ 細胞通常存在于血管周圍或干細胞生態位內，并與間充質和干細胞基因表達相關模式，促使評估 THY1 表達細胞在患者來源的 GBM 腫瘤組織中的空間分布。來自高灌注區域（即高血管分布）的圖像引導術中人類 GBM 活檢的空間定量全轉錄組分析（空間轉錄組學）顯示 THY1 表達顯著共定位于血管周圍生態位，其特征在于共表達膠質瘤干細胞和間充質特征，以及 TGFβ 信號傳導。還對源自低灌注區域的活檢進行了空間轉錄組學。該分析還表明，THY1 在血管周圍生態位內表達，并與間充質和干細胞特征顯著共定位，TGFβ 信號傳導上調。
由于已知腫瘤相關巨噬細胞會驅動惡性生長、干細胞維持和上皮間質轉化 (EMT)，我們分析了我們的空間轉錄組數據，結果顯示 THY1 也始終與巨噬細胞基因表達譜共定位。 然后，我們對 THY1 高與低區域進行了基因本體通路富集分析，結果顯示細胞粘附和細胞外基質通路在高血管和低血管樣品中富含 THY1 的區域中高度上調，支持我們的體內分析。 這些數據表明，THY1+ 細胞始終定位在一個共同的生態位內，這表明在腫瘤微環境中的信號軸中發揮關鍵作用，這有助于維持導致治療抗性的間充質和癌癥干細胞表型。
DISCUSSION
盡管采用最大安全切除和 TMZ/IR 對 GBM 進行了積極治療，但復發是不可避免的，驅動耐藥的治療可行機制尚未確定。 為了表征 GBM 治療耐藥性發展的分子基礎，開發并分析了臨床前體內復發模型以及患者衍生活檢的空間分析。 所描述研究的一個重要發現表明，在未經治療的 GBM 中，少數預先存在的、抗治療的腫瘤細胞可能會導致腫瘤復發。 具體來說，這種 THY1+ 細胞群位于血管周圍的腫瘤生態位中，強烈表達 EMT 和干細胞特征，并與巨噬細胞共定位。 研究結果還表明，在驅動間充質轉化的血管周圍腫瘤微環境中，表達 THY1 的細胞和巨噬細胞之間的關鍵細胞間相互作用可能導致腫瘤復發。
我們開發的 GBM 復發模型概括了臨床治療范式，并在復發時產生了高度耐藥的腫瘤。最值得注意的是，與治療前活檢相比，復發活檢中 THY1 的表達增加了 100 倍以上。然后，使用 THY1 作為細胞表面標記物，從未接受過治療的腫瘤中分離出一群細胞，這些細胞概括了復發腫瘤樣本的治療抗性表型。這些結果的生物學意義和臨床相關性通過以下發現得到進一步強調：THY1 表達在大多數患者復發時顯著上調，并且 THY1 表達增加與更差的無進展生存期和總生存期相關。盡管之前已經描述了 GBM 中預先存在的抗治療細胞的克隆選擇，但這里提出的研究結果為這一概念提供了強有力的證明，并確定了表征該細胞群的特定表型和基因表達譜。
來自同一只小鼠的重復配對預處理和復發腫瘤的基因表達分析表明，耐藥表型的發展也與間充質轉化、干性、細胞粘附和細胞外基質成分相關基因的表達升高有關，以及與細胞死亡相關的基因下調。間充質基因表達特征源于上皮-間質轉化 (EMT) 的生物學過程，其特點是在許多惡性腫瘤中侵襲和轉移的能力增強。在這里，我們將 THY1 提名為最
在 GBM 中獲得具有干細胞特性的間充質表型的細胞中的膜蛋白顯著上調。 THY1 是一種細胞表面受體，已在幾種非病理細胞類型中被鑒定出來，對細胞間通訊以及細胞-基質相互作用至關重要，從而導致許多生理過程，包括增殖、粘附和遷移。 THY1 已在多種惡性腫瘤中被發現，包括腎細胞癌、乳腺癌、肝細胞癌、卵巢癌和胰腺腫瘤，并且與侵襲、轉移、免疫逃避和預后不良有關，所有這些都是 EMT 的標志。
來自同一只小鼠的重復配對預處理和復發腫瘤的基因表達分析表明，耐藥表型的發展也與間充質轉化、干性、細胞粘附和細胞外基質成分相關基因的表達升高有關，以及與細胞死亡相關的基因下調。間充質基因表達特征源于上皮-間質轉化 (EMT) 的生物學過程，其特點是在許多惡性腫瘤中侵襲和轉移的能力增強。在這里，我們將 THY1 提名為細胞中最顯著上調的膜蛋白之一，在 GBM 中獲得具有干細胞特性的間充質表型。 THY1 是一種細胞表面受體，已在幾種非病理細胞類型中被鑒定出來，對細胞間通訊以及細胞-基質相互作用至關重要，從而導致許多生理過程，包括增殖、粘附和遷移。 THY1 已在多種惡性腫瘤中被發現，包括腎細胞癌、乳腺癌、肝細胞癌、卵巢癌和胰腺腫瘤，并且與侵襲、轉移、免疫逃避和預后不良有關，所有這些都是 EMT 的標志。
在我們的配對體內分析中，具有 THY1 上調的復發樣本也顯著增加了與細胞形態發生、細胞 - 細胞接觸以及細胞粘附和細胞外結構組織相關的基因的表達。 我們對人類 GBM 標本的基因本體通路富集分析證實了這些結果。 這些細胞通路介導生長、遷移、存活、分化和抗細胞死亡的信號。 Avril 等人證明 THY1/CD90+ 腫瘤與侵襲性和多灶性腫瘤呈現的相關性增加。 這些研究進一步支持了 THY1 在細胞間通訊和遷移介導治療抗性中的作用。
膠質母細胞瘤的治療耐藥性是由細胞和微環境水平上顯著的腫瘤間和腫瘤內異質性驅動的。在腫瘤微環境 (TME) 的背景下，不同的腫瘤生態位，特別是血管周圍、缺氧和侵襲性腫瘤生態位，已被證明富含抗治療的癌癥干細胞群。這些生態位支持耐藥群體并在腫瘤復發中發揮關鍵作用，因為治療難治細胞和鄰近細胞（包括免疫細胞、基質細胞、分化癌、神經膠質細胞、神經元和內皮細胞）之間的相互作用驅動靜止、侵襲、免疫抑制以及促進治療抵抗的其他特征。為了靶向這些干細胞樣、抗治療細胞，需要更好地了解在局部 TME 環境中促進抗性表型的信號級聯。最近開發的空間轉錄組學 (ST) 技術提供了原位詢問整個轉錄組表達分析的能力，從而可以評估局部腫瘤微環境。由于強有力且可重復的證據表明 THY1 陽性可作為治療抗性表型的標志物，因此可作為空間標志，我們對患者來源的 GBM 的圖像引導活檢進行了 ST 分析。該分析以無監督和空間幼稚的方式進行，然后將基因表達數據疊加到原始 H+E 成像上。我們發現，在對單個 GBM 的高灌注和低灌注區域的分析中，THY1 表達始終與間充質和莖樣特征共同定位，并且主要在血管周圍生態位中發現，驗證了我們在小鼠模型中的研究。此外，我們的 ST 研究揭示了 THY1 表達與巨噬細胞基因表達特征的共定位。腫瘤相關巨噬細胞 (TAM) 已被證明可以維持干細胞群，并通過多種相互作用促進侵襲性和免疫逃避。例如，在乳腺癌中，TAM 被證明優先滲入 THY1+ 區域，結合癌癥干細胞上的 THY1 受體，從而導致近分泌信號促進侵襲性和支持干細胞生態位，激活 SRC 和 NFκB 信號級聯。這些研究進一步表明巨噬細胞的消耗導致腫瘤生長的停滯。在神經膠質瘤中，最近的一項研究表明，THY1 表達增加與 SRC 磷酸化相關，并導致 SRC 抑制劑達沙替尼抑制 SRC 依賴性腫瘤細胞遷移以及細胞-基質相互作用。有趣的是，最近的一項研究發現，局部 THY1+ 間充質干細胞通過增加腫瘤增殖和細胞遷移來誘導膠質瘤進展。我們的數據與現有文獻相結合，強調了 TME 內細胞間相互作用在腫瘤進展中的重要性以及 THY1 在其局部生態位內旁分泌/近分泌信號傳導中的關鍵作用。
我們的體內復發性腫瘤顯示出具有 TGFβ 通路激活特征的間充質基因表達譜，這通過我們的患者來源組織的 ST 分析得到了進一步驗證。許多研究已經獨立地證明了 TGFβ 信號傳導在小鼠模型中的治療抗性、干細胞標志物的表達、神經球形成能力以及致瘤潛力中的作用。此外，抑制 TGFβ 信號傳導與乳腺癌、白血病和膠質母細胞瘤中干細胞群的消耗有關。我們的研究結果支持這一點，因為使用 LY2109761 抑制 TGFβ 信號傳導會降低間充質和干細胞樣基因的表達。此外，用 LY2109761 治療復發性腫瘤恢復了對 TMZ/IR 的敏感性。重要的是，盡管 LY2109761 作為單一藥物的療效最低，但我們觀察到當兩種方式結合使用時，對標準護理 TMZ/IR 的敏感性顯著恢復。如前所述，這一發現直接暗示 TGFβ 信號通路在賦予間充質、干細胞樣、治療抗性表型方面。最近調查各種 TGFβ 抑制劑的臨床試驗沒有顯示出前景，但通常單獨使用 TGFβ 抑制劑或與其他藥物（包括洛莫司?。┞摵鲜褂?。然而，我們的研究結果表明，TGFβ 抑制可能在復發環境中最有效地逆轉對 TMZ/IR 的抗性，特別是如果患者富含此處描述的間充質和干細胞樣特征的表達。特定的耐藥途徑可能只發生在患者亞群中，Wang 等人證實了這一點，他們在 11% 的復發患者中發現了 LTBP4（一種已知的 TGFβ 途徑激活劑）的突變。因此，確定可能受益于 TGFβ 靶向的患者亞組至關重要。 TGFβ信號通路和間充質表型的激活也與修復DNA損傷的能力增強有關，從而通過幾種轉錄因子導致化學和放射抗性。例如，在我們的復發樣本中上調的 ZEB2 已被證明會影響 DNA 損傷后的 ATM/ATR 活性。其同源物 ZEB1，通過調節 CHK1 的穩定性來促進乳腺癌的放射抗性，并通過調節膠質母細胞瘤中的 MGMT 來調節 TMZ 敏感性。
復發的發展是一個鮮為人知的動態過程。 許多人認為，治療期間的進化壓力導致克隆細胞的選擇與亞克隆細胞群的擴增和突變。 我們的研究結果表明，預先存在的腫瘤細胞亞克隆群的進化和生長也可能導致復發。 Chowell 等人證明，未經治療的腫瘤通常含有罕見的抗治療亞克隆，而這些亞克隆是標準檢測無法檢測到的。 Kim 等人的一項研究發現，腫瘤復發的遺傳途徑可能是獨特的，并且在檢查時難以預測
跨越多個樣本。 其他人已經證明來自單個腫瘤的各種亞克隆可以在體外表現出不同的治療反應，并斷言該信息可用于預測臨床反應。
最后，我們的研究提供了一種獨特的臨床相關小鼠模型來研究 GBM 的治療抗性，并定義了一種稀有細胞群，表達對 TMZ/IR 治療具有內在抗性的 THY1。這種方法為探索腫瘤耐藥機制和對患者護理至關重要的治療干預提供了獨特的機會。盡管體內免疫功能低下的小鼠模型不能完美地復制臨床范例或人類腫瘤微環境，但我們的研究結果已得到臨床研究結果的驗證。此外，我們的人類空間轉錄組分析為人類腫瘤細胞與腫瘤微環境之間的相互作用提供了額外的見解。在顱內小鼠模型中使用患者衍生的外植體而不是永生化細胞系來評估對聯合治療的耐藥性的演變，使用基因組范圍的基因表達分析也提供了我們的研究結果接近臨床環境的信心。與臨床經驗一致，我們的結果表明輔助TMZ將總生存期從7周延長至13周。動物在接受 TMZ 輔助治療時出現復發表明腫瘤確實具有抗藥性。此外，在重新植入復發性腫瘤組織時重現了對 TMZ/IR 的抗性的證明證實了這一結論。需要進一步努力來確定固有抗性細胞如何通過血管周圍生態位內的相互作用來驅動復發，這可能導致確定靶向臨床益處的途徑。在這里描述的復發模型中，我們利用 TMZ/IR 的組合來評估治療抵抗的機制。盡管 TMZ 和 IR 的組合是 GBM 患者的標準治療方法，但許多報告僅使用單一方式測試了 GBM 耐藥性的分子基礎，這雖然很重要，但并未模仿臨床環境中耐藥性的出現。
生活很好，有你更好
