膠質母細胞瘤（Glioblastoma，GBM）是一種不可治愈的原發性惡性腦癌，具有較高的基因組和細胞間異質性。膠質母細胞瘤患者平均生存期短（14個月），患者間和腫瘤內異質性對GBM靶向和免疫治療方法的成功開發提出了巨大挑戰，因此深入了解GBM細胞與其免疫微環境之間的相互作用至關重要。
本文中，作者采用scRNA-seq技術研究了單細胞分辨率下小鼠GBMs的免疫和非免疫組成，并對起始和進展過程中的人群進行了縱向分析，為GBM治療的研究提供了潛在的細胞和分子靶點。
文章詳情
文章題目：Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression
中文題目：單細胞核RNA測序：揭示膠質母細胞瘤進展過程中的免疫景觀演變
發表時間：2022.05
期刊名稱：Nature Immunology
影響因子：31.25
實驗平臺：scRNA-seq、bulk RNA-seq、qPCR
DOI：10.1038/s41590-022-01215-0
研究內容
1、scRNA-seq在GBM中識別腫瘤細胞、間質細胞和免疫細胞
研究首先通過scRNA測序確定GBM中的細胞類型，包括非免疫細胞群（CD45-）以及免疫細胞群（CD45+），在CD45-細胞群中通過Johnson-Verhaak命名法標記了腫瘤細胞群（EGFR+）；通過marker基因的表達量進一步對CD45-以及CD45+細胞群進行分層類聚，確定了Oligodendrocytes(Mog，Plp1)，Microglia(P2ry12，Tmem119)，Astrocytes(Aqp4)以及Perivascular macrophages(Cd163，Mrc1)等細胞類型。
2、不同轉錄特性的EGFR+細胞定位
為了確定5個轉錄不同的EGFR+腫瘤細胞簇分布的基礎，研究者確定了EGFR+細胞的數量和面積，結果顯示從隨著時間的推移，多個EGFR+單細胞到小的獨立簇到一個可觀測量的進展，并且早期和晚期腫瘤中存在多個克隆。Monocle3擬時序分析結果發現，簇10產生了組成簇0、22和24的細胞，而簇5則為獨立來源。并且集群0/10和5/24的EGFR信號傳導模式是不同的，在0/10簇的細胞中Tgfα表達增加，而5/24簇細胞中Hbegf表達增加?(Tgfα和Hbegf是在癌癥不同信號通路中發揮作用的EGFR配體）。在0/10和5簇的細胞中表達差異最大的基因分別是Pdgfra和Lgals1(GaL1)，為了更好地定義這兩個細胞群體EGFR下游的信號差異，研究者進一步進行了bulk RNAseq、GO富集分析以及Reactome分析，結果顯示在PDGFRA+細胞群中，上調的基因涉及少突膠質細胞的分化，并且EGFR+PDGFRA+細胞中的神經元系統、突觸功能和突觸處的蛋白質相互作用明顯增強。
3、GBMs含有一個增殖的小膠質細胞種群--顯示出促炎特性
小膠質細胞簇19的G2M和S期細胞周期基因表達水平較高。流式細胞術結果顯示，與對照組相比，在GBM進展期間GBM小鼠EdU+小膠質細胞在GBM組織中特異性增殖。EdU+GBM小膠質細胞含有與有絲分裂、細胞周期相關的上調基因，EdU-小膠質細胞表達與炎癥反應、細胞因子反應等有關的基因。在GBM中，循環小膠質細胞與非循環小膠質細胞的轉錄組具有差異，后者與促炎極化有關，并且GBM會刺激遠處小膠質細胞。擬時序分析發現簇2由簇4分化的觀點，進一步分析兩簇差異基因，發現簇4是更活躍的小膠質細胞吞噬群。綜上所述，在GBM腫瘤微環境(TME)中，存在一個小膠質細胞亞群通過增強促炎反應對腫瘤做出應答。
4、大多數GBM細胞因子來源于瘤內免疫細胞
通過RTqPCR分析小鼠GBMs CD45+和CD45-中的32種細胞因子的表達，結果顯示大部分細胞因子在CD45+細胞中表達。同時發現大多數檢查點轉錄本也在CD45+細胞群中表達，具體主要在T細胞和髓系細胞中表達。總之，這些結果表明，檢查點受體除了存在于T細胞外，還存在于先天免疫細胞；大多數瘤內細胞因子表達更多來自CD45+細胞，較少來自癌細胞。
5、腫瘤進展過程中GBM TME的縱向演變
通過RNAseq顯示，EGFR+細胞在早期和晚期GBMs中顯著增加。通過流式細胞術分析細胞類型，結果發現早期小膠質細胞占比高，而晚期巨噬細胞浸潤增加；隨著時間推移，GBMA中對側腦組織中巨噬、淋巴、單核和NK細胞明顯減少。細胞擬時序分析顯示，簇9來源于簇12，并且僅出現在GBM中。簇12富含少突膠質細胞髓鞘化和分化發育相關基因，簇9優先表達有氧呼吸功能基因，表明新衍生的少突膠質細胞能量需求發生變化。
6、在GBM進展過程中先天免疫的變化
與正常大腦相比，早期GBM中小膠質細胞簇2中促炎生物標志物以及中性粒細胞趨化及吞噬作用的表達，表明早期GBM激活小膠質細胞的促炎反應。隨著時間推移進展，BAM（13）獲得了中性粒細胞趨化、血管生成和炎癥反應相關基因的表達，巨噬細胞和小膠質細胞失去促炎極化。
7、TMZ調節PMN-MDSCs、巨噬細胞和小膠質細胞，延長生存期
高劑量的TMZ可能會通過增加小膠質細胞以及減少PMN-MDSCs和巨噬細胞的抑制群體，促進一種促炎表型，然而這并不足以誘導腫瘤清除，這表明缺乏適應性反應和耐藥性機制的發展。
主要結論
本文通過scRNA-seq和流式細胞術對基因工程小鼠正常大腦和GBM兩個發展時期的樣本進行分析，揭示了整個腫瘤過程中免疫細胞組成的大規模、全面的縱向變化。隨著GBM發展，發現GBM中存在一個高度增殖的小膠質細胞群體，并且大部分細胞因子及其受體在免疫細胞中表達，很少來自EGFR+癌細胞；在晚期的腫瘤中發現了抗炎的巨噬細胞和致癌原細胞。髓源性抑制細胞，這種演變與血腦屏障的破壞和表皮生長因子GBM+細胞的廣泛增長相一致。IR/TMZ治療能夠通過促進效應CD8T細胞功能，提高生存期。本研究結果為GBM進展過程中免疫和非免疫細胞的動態變化提供了一個新的的視角，也為疾病的治療指明了新的方向。
參考文獻
Yeo, Alan T et al. “Single-cell RNA sequencing reveals evolution of immune landscape during glioblastoma progression.”Nature immunology?vol. 23,6 (2022): 971-984. doi:10.1038/s41590-022-01215-0
