作者，追風少年i
周四了，馬上一周又要過去了，今天呢，分享一篇文章，文章在Spatially resolved multi-omics deciphers bidirectional tumor-host interdependence in glioblastoma,空間多組學分析破譯膠質母細胞瘤,值得我們研究一下。不得不說現在的研究都是以大樣本量著稱。
summary，腫瘤細胞的異質性是由于局部環境的異質性
膠質母細胞瘤是中樞神經系統的惡性腫瘤，其特點是亞克隆多樣性和發育等級中的動態適應。在這些腫瘤的空間背景下動態重組的來源仍然難以捉摸。在這里，通過空間分辨的轉錄組學、代謝組學和蛋白質組學來表征膠質母細胞瘤。通過破譯患者之間區域共享的轉錄程序，推斷膠質母細胞瘤是由譜系狀態的空間分離組織的，并適應炎癥和/或代謝刺激，讓人聯想到成熟星形膠質細胞的反應性轉化。代謝成像和成像質譜流式細胞術的整合揭示了局部區域腫瘤宿主的相互依賴性，從而產生了空間專有的適應性轉錄程序。推斷拷貝數改變強調與反應性轉錄程序相關的亞克隆的空間凝聚組織，證實環境壓力會引起選擇壓力（環境選擇）。植入人類和嚙齒動物新皮質組織的膠質母細胞瘤干細胞模型模擬各種環境證實轉錄狀態源于對各種環境的動態適應。
INTRODUCTION（空間多組學的必要性）
單細胞技術為健康人腦和惡性腫瘤中單個細胞的轉錄調控和動態進化提供了見解。高級別和低級別膠質瘤的scRNA-seq研究表明腫瘤內異質性和跨細胞狀態的動態可塑性是惡性腦腫瘤的標志，包括間充質樣（MES-like）、神經祖細胞樣（NPC-like）、星形膠質細胞樣（AC-like）和少突前體細胞樣（OPC-like）狀態。既往研究往往忽略了局部微環境在膠質瘤發生中的作用，單細胞分析僅能提供細胞間相互作用的推斷，但空間組織信息是缺失的，因而空間轉錄組學的出現使得原位表征惡性腦腫瘤的細胞間和微環境間作用成為可能。除了轉錄組外，代謝因素對膠質瘤的動態適應產生決定性影響，例如缺氧導致的代謝惡化顯著推動了基因組不穩定性，人們也越來越關注腫瘤細胞和免疫系統之間的相互作用，例如表觀遺傳免疫編輯驅動獲得性免疫入侵程序，導致膠質母細胞瘤中出現空間異質性景觀。因此，將空間水平上的多組學信息進行整合有助于破譯膠質瘤轉錄調控和動態適應的原因。
RESULTS
Atlas of spatially resolved transcriptomics in glioblastoma
從28個膠質母細胞瘤（GBM）樣本獲取了88793個跨越不同年齡組和解剖區域的空間轉錄組圖譜（stRNA-seq），并補充了空間代謝組學（基質輔助激光解析電離, MALDI）和蛋白組學（成像質譜流式，IMS）的分析數據（下圖）。
為了解決空間轉錄組的精度問題，文章提到了兩種方式：
-
（1）a machine-learning-based segmentation technique to predict the exact number of nuclei within each spot
識別每個spot的細胞數 (2) an artificial neural network (ANN) model trained to predict the number of tumor cells per spot, based on a simulated dataset consisting of randomized
cellular assemblies from paired st-/scRNA-seq datasets (n = 5)(也是我們常用的方法)
為了使結果與組織學分類的普遍黃金標準相結合，根據常春藤 GAP 組織學分類系統預測了逐spot組織學表型（這樣的工作常人真的是難以完成）
Deciphering spatially resolved transcriptional heterogeneity
研究的目標是通過將它們與現有的轉錄和組織學分類聯系起來來識別重復出現的轉錄空間模式（也因此取樣的時候含有腫瘤細胞少的spot全部去除）。GBM transcriptional subgroups 的空間定位，如最初使用 bulk RNA-seq 描述并使用 scRNA-seq 進一步表征，仍不清楚。我們和其他研究者人為transcriptional subgroups在空間上是分離的，并在腫瘤內行使不同的功能。為了解決空間上的轉錄異質性，首先必須解決的就是空間表達模式，再將這些結果匯總到整個隊列中。為了實現這一目標，依次消除了混雜因素，包括患者間變異性、技術偽影和測序深度的變異性。隨后整合了患者空間加權相關矩陣（逐個聚類），然后是層次聚類，確認了五個重復的空間不同轉錄程序的空間分離。這種方法使作者能夠了解在整個隊列中穩健表達的患者特異性簇中轉錄程序的生物學意義。其中，在90%的樣本中都包含5個一致表達的轉錄程序，分別為與缺氧反應和糖酵解基因相關、以少突膠質細胞特征為標志、富集放射狀神經膠質細胞或炎癥相關基因，以及以神經發育為特征的類群。
識別空間轉錄轉錄程序主要分為以下三個步驟：
- identification of patientwise robust regional transcriptional programs
- horizontal integration across patients using shared transcriptional programs as anchors and spatially weighted correlation to explore colocalization of transcriptional programs
- characterization of the spatial organization of shared programs
空間上不同的轉錄狀態獨立于細胞周期狀態，并且與現有的分類系統一致
空間上不同的轉錄程序和亞克隆結構
拷貝數改變（CNAs），包括癌基因的局部擴增或腫瘤抑制因子的丟失，是惡性細胞的標志，而CNAs與特定細胞狀態相關聯，在缺氧反應類別中，確定了作為獨立亞克隆事件發生的CNAs的顯著積累。利用推斷的 CNA 研究了基因組改變和空間上不同的轉錄程序之間的關系
作者進一步研究空間上不同的轉錄多樣性是否可以直接反映腫瘤內的遺傳亞克隆。作者通過 CNA 的患者特異性層次聚類重建了克隆體系結構。鑒定了 57 個遺傳亞克隆，每個樣本跨越 2 到 6 個亞克隆。然后，作者確定了每個亞克隆中個體、空間上不同的轉錄程序的分布。分析表明，在 26.32% 的所有亞克隆中，單一轉錄程序占主導地位。這些發現得出結論，盡管亞克隆偶爾偏向于空間 OPC (8.77%) 或反應性缺氧程序 (10.52%)，但克隆結構對空間不同轉錄程序的發生影響有限。
GBM中與反應性缺氧程序相關的代謝改變（關于空間代謝組學，我目前仍然是一片空白）
為了進一步探索空間上不同的反應性缺氧模式，作者使用空間代謝組學技術從連續用于 stRNA-seq 的組織切片（患者，n = 6) 。實施了一個類似于 stRNA-seq代謝譜的工作流程，降維揭示了前兩個主要成分中的主要差異，從而確定了三個顯著的代謝亞組后校正集群穩定性。功能代謝分析顯示在第一代謝模塊（M-G1）磷酸戊糖途徑顯著富集。第二個代謝亞組（M-G2）的特征是磷酸腺苷酸代謝富集。最終的代謝亞組（M-G3）在糖酵解和氨基糖代謝方面高度富集。
針對空間上不同的轉錄程序反應性缺氧，在作者的綜合分析（WNN 聚類）中作為一個獨特的簇出現。組織學上，分配給反應性缺氧程序的大多數斑點代表壞死邊緣。作者假設低氧代謝導致基因組不穩定性在空間隔離的生態位中積累。這些“反應島”代表了從頭的潛在來源基因組改變有助于腫瘤細胞產生治療抗性。
進一步探索富含反應性缺氧特征的區域。區域被定義為缺氧核心，并富集糖酵解途徑。還顯示出多條染色體（8p、9p、13q、19q 和 21q）的獨特損失和增加，這種變異最有可能由缺氧核心區域內的單個亞克隆解釋，這證明了缺氧相關代謝是一種潛在的假設基因組不穩定性的驅動因素。
反應性缺氧區域積累染色體改變
作者分析了來自 TCGA 數據庫的樣本（患者 GBM IDH1/2野生型 n = 357），根據患者的缺氧基因表達評分對患者進行分類。缺氧驅動的腫瘤顯示染色體改變顯著增加，證實了代謝和基因組不穩定性之間的關系。結果主要表明，低氧/氧化應激增強了基因組的不穩定性，有助于在亞克隆選擇的支持下加強 GBM 的微進化以恢復彈性。為了通過實驗驗證作者的假設，作者在常氧和缺氧條件下培養原發性患者來源的GBM 細胞系2-6 周（患者 n = 4）。拷貝數變異揭示了 CNA 譜的差異，在慢性缺氧條件下 CNA 事件的顯著積累證實了壓力誘導的 CNA 改變的假設。
作者通過分析常氧和缺氧條件下CpG 位點cg12434587 和 cg12981137處的 O-6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶 (MGMT) 啟動子甲基化來探索缺氧代謝對DNA 甲基化的影響。細胞系當暴露于缺氧時，在常氧下具有未甲基化的 MGMT 啟動子會產生高甲基化。這些發現進一步加強了關于代謝驅動的 CNA 的假設，其中大多數從頭重排必須被視為隨機事件，有助于腫瘤的亞克隆進化。
低氧代謝調節GBM中的“去或成長”潛力
在對空間分辨轉錄程序的初步表征中，反應性缺氧程序在非循環細胞中顯著富集。表明缺氧應激會觸發細胞周期停滯，特別是 S 期停滯。導致假設缺氧驅動的 S 期停滯有助于基因組不穩定性的積累。
GBM 細胞的基線轉錄狀態可以分配給“發育”（AC-、OPC-或 NPC 樣）程序。在空間上，代謝譜顯示磷酸戊糖途徑 (PPP) 的富集。由于增殖和腫瘤生長，會發生越來越多的營養和氧氣缺乏，迫使采用代謝程序進行糖酵解。這種現象是 PPP 和糖酵解之間的相互轉換，與腫瘤細胞的生長或生長潛力有關，表明 PPP 支配著由生長的腫瘤細胞組成的區域。
當缺氧發生時，這種低氧誘導的糖酵解轉換隨后的誘導，這有助于細胞逃逸/遷移到含氧量正常的區域。由于在缺氧條件下發生的細胞周期程序的下調，會發生 S 期停滯，導致隨后從頭CNA 的積累。作者假設這些受缺氧影響的細胞中有很大一部分隨后進入凋亡狀態，導致在 GBM 中看到的特征性壞死。只有一小部分細胞通過遷移相關轉錄程序的上調成功逃脫。除缺氧外，據報道，其他壓力源（如放射或化療）會導致 GBM 出現這種與壓力相關的擾動。
根據這個模型，可以看到低氧代謝和細胞遷移之間的反比關系。為了探索代謝改變區域中遷移基因表達特征的富集，作者確定了特定基因表達特征的低富集和高富集之間的定向梯度的空間方向。每個點的方向向量是基于其局部鄰域中所研究的基因表達特征的分級富集。這些向量場計算使作者能夠近似空間基因表達軌跡，從而能夠識別空間上相反的轉錄途徑。基于這些矢量場計算，作者報告缺氧響應和遷移特征顯示反向空間軌跡。總之，作者的研究結果為代謝變化和氧化應激是基因組多樣性的潛在互惠驅動因素提供了證據，從而導致 GBM 中的克隆進化。
探索反應性免疫區域的腫瘤-宿主相互依賴性
通過選擇反應性免疫和反應性缺氧計劃區域內的 ROI，并從分類為神經元分化的區域中控制 ROI。得到分割后 82,179 個細胞的綜合蛋白質組圖（空間白蛋白組學）。
作者的分析顯示骨髓細胞和淋巴樣細胞在歸類為反應性免疫的區域中。為了研究免疫富集區域的腫瘤細胞分化，作者通過將細胞細分為放射狀膠質細胞（EGFR + HOPX +）、反應性免疫（EGFR + CHI3L1 + VIM +）、空間 OPC（EGFR + OLIG1 + )、神經發育(EGFR + SNAP25 + CALM2 + ) 和反應性缺氧 (EGFR + VEGFA + )。反應性免疫（EGFR）的獨家富集+ CHI3L1 + VIM + ) 細胞僅在轉錄定義的反應性免疫定位中得到證實。
為了補充關于免疫系統和 GBM 之間細胞關系的發現，作者根據腫瘤細胞與淋巴或骨髓細胞之間的距離量化了它們之間的細胞連接性 ，證實了腫瘤細胞與轉錄定義的反應性免疫區域中的免疫區室之間的細胞相互作用增強。接下來，作者探索了不同 ROI 中細胞類型的分布。作者證實了在反應性免疫和缺氧中疑似富集 AC 和 MES 樣細胞。OPC 樣細胞主要富集于神經發育ROI。此外，反應性免疫和缺氧區域均顯示腫瘤相關骨髓細胞 (TAM) 和 T 細胞的顯著富集。
鑒于 T 細胞在兩個反應區域都富集，作者研究了 T 細胞上的平均PD-1 蛋白水平 (CD3+ )，與反應性缺氧和神經發育相比，反應性免疫區域內顯著增加，表明反應性免疫 ROI 中的局部免疫抑制增強。此外，代表 GBM 免疫景觀的 scRNA-seq 數據集證實了腫瘤反應性免疫區域中記憶和耗盡的 T 細胞的富集
環境條件有助于雙向亞型轉變
雖然已有大量研究表明炎癥環境驅動轉路適應從而導致GBM異質性，但是尚不清楚這種轉變是否可逆，如果將微環境引起轉錄重編程的腫瘤細胞重新暴露于健康大腦會發生多大程度的變化呢。于是研究人員將MES樣原發性患者衍生細胞接種到培養4天的來自不同年齡的多個人類和大鼠供體的皮層組織切片中，通過scRNA-seq進行轉錄分析。在中青年人類供體中，OPC-、AC-和NPC樣細胞顯著增多，而老年供體中MES樣/反應性細胞類型顯著增多，在嚙齒類工體環境中培養的GBM細胞表現出MES和AC樣轉錄特征的富集，說明宿主環境在重塑轉錄程序方面發揮重要作用。
討論
在過去幾年中，通過單細胞分析技術進步取得的眾多發現徹底改變了對腫瘤異質性和可塑性以及潛在治療選擇的理解。然而，尚未研究腦腫瘤空間組織的重要性。在這里，作者揭示了微環境與GBM轉錄異質性的時空變化之間的雙向和單向相互作用的見解。揭示了五個空間上不同的轉錄程序的存在，這些轉錄程序以共享的轉錄特征和專有的基因組改變為標志。盡管在 GBM 中有 CNA 的先前描述，但以前沒有報道過區域模式和與轉錄程序的關聯。并對對細胞狀態、組織學模式和空間專有轉錄程序進行整體比較。
這種以空間分辨方式在各種分子水平上全面表征 GBM 有助于發現細胞狀態的動態適應及其在腫瘤微環境中的空間關系。作者數據表明，在 S 期停止后，嚴重缺氧等代謝改變會導致增殖受損，從而導致 CNA 的顯著積累。這種現象已在其他癌癥類型中報道，并且存在足夠的證據詳細說明缺氧條件下基因組不穩定性的增加。作者在 2D 細胞培養和 TCGA 數據中的結果和驗證表明，區域缺氧代謝代表了基因組不穩定性的潛在儲存庫，并代表了微進化的驅動因素，從而使耐藥表型的進化成為可能。
Method
我們主要來關注一下空間的CNV估計
關于SPATA，大家可以參考文章SPATA
CNV分數矩陣的聚類，inferCNV選擇subcluster模式會進行層次聚類。
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