組織優化（TO, Tissue Optimization）實驗，主要是用于檢測樣本是否適合進行空間轉錄實驗，以及摸索最佳透化時間。
不同的組織類型以及切片厚度，對組織透化的時間均有影響只有確定最佳透化時間之后，才可以開始空間基因表達的正式實驗。
一、實驗概況
在樣本準備好并放置在TO slide上后，整個實驗大約3個小時。
二、玻片介紹
TO Slide上有8個捕獲區，8X8mm，oligo上包括poly(dT)捕獲到mRNA，不包括spatial barcode，不構建文庫，** 每一個組織用一張玻片**。
Tips
- 試劑保存在適合的條件下，RT的Mix需要放置在冰上使用；
- 包括組織的Slide，只能在-80℃中保存4周；
- 操作過程中，Slide正面朝上，不要觸碰組織；
- 卡夾在使用前，可以使用普通的玻片進行練習；
- 成像前為了放置熒光淬滅，可以先用Test Slide進行設置參數；
- 操作前，避免引入氣泡；
- 樣本冷凍、包埋以及切片，需要嚴格按照protocol建議的完成。
三、透化及熒光cDNA合成
固定和染色后的樣本，采用不同的時間，進行透化處理，然后捕獲mRNA，用帶有熒光的核苷酸進行反轉錄合成cDNA。
Tips
- 透化所用酶以及試劑在室溫平衡，不同的試劑平衡時間不同。如Permeabilization Enzyme 15min，不超過20min；Switch Oligo室溫平衡30min；
- 透化過程中，避免蒸發，使用Slide Seal覆蓋Slide Cassette；
- 關于透化時間，建議0-30min內。其中一個捕獲區，為陽性對照，加2 ulRNA（1ug/ul）。另一個捕獲區，不進行透化處理，不加透化酶。不同的樣本透化時間的設置可以不同，如果一次沒有完全找到適合的透化時間，需要進行第二次。
四、組織移除及成像
組織經酶處理，移除后只剩下帶有熒光標記的cDNA，然后成像，一次成像包括8個捕獲區。
對比H&E和熒光成像，選擇熒光信號最強、RNA擴散最少、內部組織結構最清晰的時間點，作為最佳透化時間點。如果兩個時間點差不多，選時間長的。
