編者按：隨著10X genomics于2019年11月發(fā)布Visium Spatial Gene Expression Solution，空間轉錄組學（Spatial Transcriptome，ST）研究如火如荼。
愛麗慕斯（ANIMUS）團隊，經(jīng)過近一年不懈努力，隆重推出10X 空間轉錄組技術服務，提供空間轉錄組方案設計、實驗定制、生信分析和數(shù)據(jù)可視化等高水平一站式服務。隨著2020年8月利用空間轉錄組研究AD的Cell文章見刊，國內外團隊如斯坦福大學Robert Roth等、浙江大學Jie Liao和Xiaohui Fan等對空間轉錄組學綜述文章更是點燃這一領域。這里愛麗慕斯團隊對相關文章和進展進行總結， 以饗讀者。
本文共9310個字，建議閱讀18分鐘.
一 細胞學研究時代
一個多世紀前，現(xiàn)代病理學之父魯?shù)婪颉ぞS喬（Rudolph Virchow）開創(chuàng)了細胞時代，他指出所有疾病都起源于細胞。矛盾的是，盡管人們一致認為細胞是多細胞生物的基本單元，但現(xiàn)代細胞和分子生物學知識主要來源于細胞群體的批量分析，而目前對器官和組織等進行基因表達分析的主流技術依然是批量RNA測序（bulk RNA-seq）。雖然bulk RNA-seq能夠全面快速地獲得特定細胞或組織在某一狀態(tài)下幾乎所有mRNA的序列和表達信息，但其分辨率低，結果是很多細胞混合后的“平均值”，差異表達基因存在一定假陽性和假陰性，組織異質性被掩蓋（圖1）。
二 單細胞研究
因此，對組織和器官進行單細胞分辨率研究越來越重要。早期單細胞研究主要使用定量聚合酶鏈反應（PCR）、熒光活化細胞分選法（FACS）和免疫熒光原位雜交（FISH），只能研究數(shù)量有限的基因或蛋白質。隨著技術進步，鑒定到基因或蛋白的通量日益增加?，F(xiàn)在，質譜流式細胞技術（CyTOF）使用金屬結合抗體可同時檢測多達40種蛋白質。這些技術有助于描述細胞類型和亞型，但它們依賴于一組預先設計的基因或蛋白，這可能會使研究產(chǎn)生偏倚，并且需要先驗知識，比如提前確認細胞表面的關鍵分子標志物，而這些分子標志物往往是未知的。 相比之下，單細胞基因組學提供了在單細胞水平上以一種無偏倚、高通量方式來分析組織的方法。2009年，湯富酬教授等人提出了第一個基于改進的cDNA擴增的單細胞轉錄組測序方法（scRNA-seq），在含有裂解緩沖液的Eppendorf管中分離單個卵母細胞（Tang’s Method）。兩年后，Navin等人從乳腺癌樣本中產(chǎn)生了第一個單細胞基因組。正是這些開創(chuàng)性研究打開了單細胞基因組學新領域大門。近10年來，各種單細胞研究方法層出不窮（見圖2和表1），所有步驟都脫胎于bulk RNA-seq protocols。這些scRNA-seq方法都需要解離實體組織以獲得單細胞，并對其RNA進行標記和擴增以進行測序，差別主要在于單細胞分離技術。
目前主流細胞分離技術如下：
Micropipetting micromanipulation（口吸管技術）；
Laser capture microdissection（激光捕獲顯微切割技術）；
Fluorescence activated Cell Sorting，F(xiàn)ACS（流式細胞儀技術）；
Microdroplets（微滴技術）；
Microfluidics（微流體技術）；
單細胞技術主要應用于以下方向：
研究一個組織中細胞種類；
識別罕見或未知細胞類型或狀態(tài)；
闡明在分化過程或時間及狀態(tài)變化中基因表達的改變；
找出在不同條件下（如生理和病理）在某一特定類型細胞中差異表達基因；
探究細胞類型之間基因表達的變化，同時納入空間、調控和（或）蛋白質信息；
單細胞測序常見分析方法包括：
探究異質性 (Studying heterogeneity)；
譜系路徑分析 (Lineage tracing study)；
隨機基因表達研究 (Stochastic gene expression study)；
單細胞測序揭示了過去我們認為透徹研究疾病中存在著未知細胞類型，例如發(fā)現(xiàn)肺離子細胞(ionocyte cells)，這可能與囊性纖維化病理學機制有關。 單細胞方法比批量分析的核心優(yōu)勢在于，保留單細胞信息可以揭示罕見細胞特性和生物學意義上的細胞間異質性。然而，與循環(huán)血細胞不同的是，固體組織和器官必須通過機械或酶分解才能進行單細胞分析。這個過程不可避免地會導致位置信息丟失，使得無法評估單細胞基因組和轉錄組在整個組織中空間組織方式，同時也會在一定程度上改變細胞狀態(tài)及其基因表達狀態(tài)。
三 空間轉錄組研究
空間異質性是器官功能的一個重要特征。人體組織是高度復雜系統(tǒng)，由多達數(shù)萬億個細胞組成，這些細胞在種類、時間和空間上各不相同，但它們相互協(xié)調，形成獨特微環(huán)境，以維持器官功能和處理信息，進而決定細胞特性。在哺乳動物器官中，具有不同功能類型和發(fā)育（時間）和區(qū)域（空間）差異的無數(shù)細胞構成了大多數(shù)轉錄異質性。雖然高通量單細胞RNA測序（scRNA-seq）在推斷細胞類型和軌跡方面取得了相當大成功。目前一些策略已經(jīng)應用于揭示細胞命運決定（cell fate decisions）、細胞譜系（cell lineages）和發(fā)育軌跡（developmental trajectories），如偽時間分析（pseudotemporal analysis）、可標記細胞來源的內源性條形碼（endogenous barcoding）、以及在特定時間間隔內連續(xù)取樣（continuous sampling）。然而，空間異質性仍然是一個棘手問題，因為細胞一旦在懸浮液中分離，就會丟失其位置信息。
因此，幾十年來，在空間水平研究組織基因表達的技術層出不窮（圖3）。從早期使用熒光原位雜交（FISH）到目前單細胞分辨率下空間轉錄組，以及最近的multiplexed error robust FISH（MERFISH）。
這里把不同方法根據(jù)其類別用不同形狀、符號和大小顯示?？s寫：ExFISH, expansion FISH; FISH, ?uorescencein situhybridization; FISSEQ, ?uorescencein situsequencing; GEO-seq, geographical position sequencing; HDST, high-de?nition spatial transcriptomics; ISS,in situsequencing; LCM, laser capture microdissection; MERFISH, multiplexed error-robust FISH; MAPseq, multiplexed analysis of projections by sequencing; osmFISH, ouroboros single-molecule FISH; PLISH, proximity ligationin situhybridization; secFISH, sequential FISH; smHCR, single-molecule hybridization chain reaction; SRM, super resolution microscopy; STARmap, spatially-resolved transcript amplicon readout mapping; TIVA, transcriptome in vivo analysis; TSCS, topographic single-cell sequencing.
現(xiàn)有空間轉錄組方法可分為四類：
1.基于計算策略和組學實驗相結合的空間重建方法；
2.基于激光捕獲顯微切割（laser capture microdissection，LCM）與NGS相結合的直接測量法；
3.基于成像的原位轉錄組學；
4.基于寡核苷酸空間條形碼和NGS的方法；
每種方法都有其優(yōu)缺點，比如基因概況（即檢測到基因種類數(shù)）和細胞數(shù)（即一次分析細胞個數(shù)）的差異，圖3和表2顯示了用于解碼空間異構性的不同方法的通量。
計算策略的空間轉錄組
由于基于流式細胞的scRNA-seq丟失了細胞坐標信息，而RNA-staining方法只檢測了總轉錄物的一部分，因此，計算生物學通過整合多尺度數(shù)據(jù)來重建組織的空間轉錄組。例如，Satija等提出了Seurat（圖4A），這是一個R包，通過結合scRNA-seq數(shù)據(jù)和marker基因的in situhybridizations來推斷細胞定位。比如，通過SMART-seq獲得斑馬魚胚胎發(fā)育過程中851個細胞的單細胞基因表達，后續(xù)分析將細胞分為不同類型，并為每種細胞類型生成landmark基因。然后，landmark基因的FISH數(shù)據(jù)提供了這些表達模式的空間分布，產(chǎn)生了landmark基因在整個組織中的表達密度。最后根據(jù)marker基因的表達譜和標記基因的表達密度可以對單個細胞進行定位。最近，這個小組發(fā)布了Seurat第三個版本，用于跨數(shù)據(jù)集的單細胞信息綜合集成。類似地，Achim等提出了一種方法，通過比較scRNA-seq數(shù)據(jù)和從單個基因表達圖譜中獲得的空間基因表達（positional gene expression）來定位單個細胞。
此外，Durruthy-Durruthy等建立了一個使用單細胞基因表達數(shù)據(jù)的空心球形態(tài)學來實現(xiàn)組織3D重建的標準方法。這種計算方法在單個細胞的大量轉錄組數(shù)據(jù)中，充分利用其內在基因表達模式或共表達趨勢，從而獲得細胞間的context；然而，這些演繹方法在某些情況下是受限的，只呈現(xiàn)特定組織的空間趨勢或總體布局。因此，需要更深入的分析，才能實現(xiàn)對組織中實際的單細胞轉錄本的更精確定位。
基于LCM的方法
獲取攜帶精確位置信息轉錄本的另一種策略是使用LCM從組織切片中分離單個細胞或整個目標區(qū)域，LCM是一種顯微鏡引導的強大切割系統(tǒng)，將紫外光作為無接觸和無污染的刀片。目標細胞被切割并收集在不同容器中以盡量減少空間信息丟失。隨后，細胞可以通過直接RNA-seq或預先設計的空間條形碼來標記等多步驟過程來獲得其表達譜。
LCM-seq（圖4B）旨在為基于LCM的直接scRNA-seq提供標準方法。例如，使用LCM與smart-seq2結合，對小鼠運動神經(jīng)元和人類死后組織進行精確空間轉錄組分析。研究表明，scRNA-seq是可行的，基于LCM-seq的成功率為62%，在不同情況下表現(xiàn)出相當?shù)谋憷浴４送猓?016年中科院分子細胞科學卓越創(chuàng)新中心景乃禾&中科院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院彭廣敦開發(fā)了geographical position sequencing (GEO-seq），該方法實現(xiàn)了對少量細胞的整個轉錄本進行分析的同時，利用某些特定關鍵基因（zip-code基因）將細胞映射回其原始位置，因此保留了細胞原始空間位置信息（圖4B）。
此外，Casasent等開發(fā)了一種基于LCM方法，稱為topographic single cell sequencing（TSCS），以比較原位導管癌（DCIS）區(qū)域和浸潤性導管癌（IDC）區(qū)域細胞之間基因組變異。將組織切片放在載玻片上，用蘇木精和伊紅（H&E）染色，以便在顯微鏡下識別單個細胞核（圖4B）。然后使用LCM系統(tǒng)從組織切片中捕捉單個細胞，同時記錄每組坐標。接下來，將細胞分離到一個預先編碼的緩沖液中，在緩沖液中進行裂解和全基因組擴增（WGA）。最后，對所有cDNA的NGS建庫測序。通過LCM總共分離到1293個單細胞，隨后進行單核測序（SNS）。
基于LCM的轉錄組學或基因組學成功地獲得了單個細胞的空間轉錄本，盡管其通量很低，然而，在新技術（即可以標記出成千上萬個單一的特定位置細胞的空間條形碼技術）出現(xiàn)之前，它可以粗略地將少數(shù)細胞的數(shù)據(jù)整合到構成器官的巨大背景中，就像向海洋中注入水滴一樣有用。
基于成像的In Situ轉錄組學
基于成像的原位轉錄組學使得細胞通量不再是個問題。早期能夠檢測單個轉錄本方法被稱為單分子FISH（smFISH），它使用FISH以亞細胞分辨率同時測量一到多個（通常為3或4個）mRNA。隨后，人們致力于用多通路smFISH以增加每個細胞位點可檢測的mRNA種類。Expansion FISH（ExFISH）可以從數(shù)十個培養(yǎng)細胞中研究7個靶基因，而proximity ligationin situhybridization（PLISH）可檢測固定組織中8個基因。隨后的osmFISH能夠同時從組織切片中鑒定數(shù)千個細胞的33個基因。Sequential FISH（seqFISH）是另一種通過多輪雜交來編碼單個細胞內不同轉錄本方法。隨著這項技術進步，檢測能力已從固定細胞（?xed cells）中12個基因增加到組織切片中10000多個基因。
類似地，另一種MERFISH方法可以顯著增加單個細胞中可測量數(shù)量，高達1000個mRNA（圖4C）。MERFISH不是設計一個獨特探針靶向特定mRNA，而是整合一個框架，將每個RNA原位轉化為一個獨特N位字符（N-bit word）。通過靶向特定RNA集合的子集，如果觀察點上存在熒光點，則輸出結果為1，否則為0。經(jīng)過N輪雜交后，理論上可以探測到2N-1種RNA。然而，隨著N輪的增加，檢測錯誤率逐漸增加，導致可檢測mRNA種類縮小到1000個。對N位字符進行解碼后，可以將相應mRNA映射到它們的空間位置。值得注意的是，近年來MERFISH在分析超過100萬個細胞和靶向10000個mRNA這兩個方向上得到了極大改進。
18年斯坦福大學Karl Deisseroth教授新開發(fā)的STARmap（spatially-resolved transcript amplicon readout mapping），可直接靶向1000多個基因。與其他基于成像的方法相似，水凝膠-組織化學使得組織內每個細胞成為RNA成像的可觀察的理想容器（圖4C）。一個巧妙的掛鎖系統(tǒng)（padlock system）設計，由一對引物和一對掛鎖探針組成，通過分子內交聯(lián)（speci?c ampli?cation of nucleic acids via intramolecular ligation，SNAIL）對核酸進行特異性擴增。值得注意的是，只有當兩個引物都與同一個mRNA對齊時，掛鎖探針才能進行滾圈擴增并產(chǎn)生一個稱為擴增子的DNA納米球。每個掛鎖探針都有一個5位堿基條形碼（庫容量為1024），作為基因特異性標識符。為降低單堿基測序的錯誤率，與傳統(tǒng)僅編碼單個堿基方法相比，本研究定制了一種稱為動態(tài)退火和交聯(lián)以減少錯誤的測序方法（sequencing with error-reduction by dynamic annealing and ligation，SEDAL），將兩個連續(xù)堿基編碼為一種顏色。經(jīng)過六輪測序后，每個條形碼都被解碼并注釋到特定mRNA上。使用這種方法，可以評估細胞類型的空間分布，并獲得完整組織的三維視圖。相比之下，有兩種與STARmap原理相似的早期方法，稱為原位測序（in situsequencing，ISS）和熒光原位測序（fluorescencein situsequencing，F(xiàn)ISSEQ）。ISS是一種比STARmap靶向mRNA數(shù)目更少和探測準確性更低的靶向檢測方法。FISSEQ通過讀取每個轉錄本的27個堿基，能夠在培養(yǎng)的成纖維細胞中非特異性檢測到超過8000多種RNA。然而，由于難以在原位生成長片段reads，因此無法應用于組織切片。最近，F(xiàn)ürth等提出一種新方法，即原位轉錄組可及性測序（in situtranscriptome accessibility sequencing，INSTA-seq），允許對目前基于雜交的方法或受限于短片段的原位測序無法區(qū)分的小調控變體（small regulatory variants）進行無偏研究。
基于成像的原位轉錄組學在很大程度上增加了可檢測區(qū)域，但也帶來了一些挑戰(zhàn)性問題。例如，一些smFISH方法可以在整個組織中實現(xiàn)定量mRNA成像。然而，單個細胞很難從復雜背景（包括信號干擾、轉錄物積累和細胞擁擠）中提取出來。此外，與RNA-seq相比，這些靶向方法有較高錯誤率并需要預選基因。當使用一組探針作為誘餌來獲取特定RNA全部信息時，很容易出現(xiàn)錯誤。與RNA-seq另一個主要區(qū)別是，靶向方法不能檢測新序列或小序列變體。
空間條形碼結合NGS
考慮到使用探針來原位靶向檢測RNA方法的缺點，人們對直接原位測序或對組織切片進行空間標記的興趣越來越大。
空間轉錄組學（Spatial transcriptomics，ST）（圖4D）通過一種具有大量分散分布100μm大小微孔的特制載玻片來捕獲mRNAs。每個孔都覆蓋一或多個寡核苷酸鏈，該寡核苷酸鏈包含一段每個微孔特異性的空間條形碼，和一個與poly A互補以捕獲mRNA的poly T尾巴。在一個6 mm×6 mm正方形捕獲區(qū)域中，總共產(chǎn)生了1007個條形碼微孔。經(jīng)過酶透化后，組織切片中mRNAs從細胞中釋放到玻片上，被微孔內寡核苷酸捕獲。在載玻片上進行cDNA合成。隨后利用NGS進行RNA-seq，基于空間條形碼獲取其原始空間位置信息。最近，高分辨率空間轉錄組學（high-definition spatial transcriptomics，HDST）已經(jīng)被開發(fā)出來，它使用分割池方法（split-pool approach）產(chǎn)生高分辨率（2μm）、高密度（數(shù)百萬）微珠陣列。與ST相比，HDST明顯提高了空間分辨率，但HDST平均每個微孔（well）有7個唯一分子標識符（unique molecular identifiers，UMI），嚴重限制了其測量高豐度基因能力。
為了給高通量實驗提供足夠空間信息，Slide-seq（圖4D）應運而生。在Slide-seq中，首先在涂有橡膠的玻璃蓋玻片表面填充一層10 μm的特異性條形碼微珠（beads）。與其他高通量scRNA-seq方法中使用的微珠類似，每個微珠上條形碼是隨機分布的。因此，先對每個微珠上寡核苷酸條形碼進行識別，再進行混合測序。為解決這一問題，Slide-seq后續(xù)利用SOLiD化學技術（sequencing by oligonucleotide ligation and detection）來讀取每個柱子上不同條形碼。先識別每個10 μm捕獲點（spot）中特異性空間標識符，再行RNA-seq，因此寡核苷酸捕獲的mRNAs可以映射回它們的原始空間坐標。Slide-seq以單細胞分辨率對150萬個捕獲點進行測序。不幸的是，與Drop-seq相比，Slide-seq每個微珠的UMI更少。
一旦轉錄水平和空間位置有一一對應關系，空間條形碼結合NGS技術構成了一個直觀概念來定位大量單點。因此有兩種方法，一是合成足夠多特異性條形碼并將其分配給特定捕獲點，二是增加一個測序步驟以定位每個編碼的微珠。然而，這兩種方法都很昂貴，而且都不能在單個細胞中獲得轉錄本。
基于條形碼和NGS的空間轉錄組，近幾年有了新突破。2016年，瑞典皇家理工學院Joakim Lundeberg（瑞典Spatial Transcriptomics公司聯(lián)合創(chuàng)始人）在Science上發(fā)文，利用基因芯片技術將位置信息保留在芯片上，再利用二代測序技術對組織中RNA進行測序，從而生成組織切片上完整的基因表達圖像。2018年底，10X Genomics宣布收購Spatial Transcriptomics，并于2019年11月發(fā)布Visium空間基因表達解決方案（Visium Spatial Gene Expression Solution）。
Visium空間轉錄組實驗流程包括4個步驟：
1.樣本制備（Sample Preparation，SP）。新鮮組織樣本進行異戊烷固定、液氮速凍和OCT包埋；隨后用冷凍切片機進行切片，準備5~10張切片提取RNA并進行質量評估（要求RIN值>7.0）；
2.組織透化（Tissue Optimization，TO）。將切片放置在TO玻片上，用不同時間梯度的透化劑處理組織，使細胞中mRNA落入玻片并與玻片上寡核苷酸標簽結合后，進行cDNA合成，熒光成像，以確定最佳透化時間。隨后取切片在文庫制備（LP）玻片上進行正式透化實驗。
3.cDNA合成和文庫制備（cDNA generation & Library Preparation）。mRNA的poly A尾巴與探針標簽poly T互補，并合成cDNA，構建10x Visium文庫 。
4.測序和分析（Sequencing & Data Visualization）。進行PE150測序，并使用相關工具比如Space Ranger和Loupe Browser 等軟件進行可視化分析。
10X Visium空間基因表達解決方案技術核心在于2種載玻片，1種是組織優(yōu)化玻片，包含8個捕獲區(qū)域，其中6個區(qū)域分別設置6個不同透化時間，另外兩個區(qū)域1個為不加透化劑的陰性對照，另1個為陽性對照，不放組織切片，而是直接加入RNA。其實驗流程為：固定→染色→明場拍照→組織透化→熒光cDNA合成→組織移除→熒光掃描，根據(jù)熒光強度判斷最優(yōu)透化時間。1種是文庫制備玻片（圖6），上有4個捕獲區(qū)域（6.5x6.5mm，圖6中4個小方框），每個捕獲區(qū)域含4992個用條形碼編碼的捕獲點（barcoded spots，圖6中彩色圓點），直徑為55μm，兩個spot中心的間距為100μm，每個spot都有數(shù)百萬條寡核苷酸標簽，每個spot上所有寡核苷酸標簽的Spatial Barcode序列都是相同的，而不同spot之間Spatial Barcode是不同的，根據(jù)mRNA對應的Spatial Barcode（spot的位置信息）就可以獲取其空間位置信息。
10X Visium空間轉錄組，無需解離單細胞來制備單細胞懸液，與其它方法相比，實驗流程非常簡單，只需提供H&E染色切片，就可得到切片相應位置基因表達信息，將傳統(tǒng)組織學技術的優(yōu)勢與RNA測序的高通量特點相結合，在組織中呈現(xiàn)基因表達空間分辨率水平的可視化信息。除切片機和顯微鏡外無需額外購買昂貴硬件設備，可以實現(xiàn)相對低成本、一次獲取5000~10000個細胞和幾乎全部轉錄本，通量相對較高，主要缺陷是沒有達到單細胞分辨率（每個spot中有1-10個細胞）。
四 空間轉錄組應用
雖然目前空間轉錄組學技術尚不完善，但已廣泛應用于臨床和生物學研究中。
發(fā)現(xiàn)疾病的空間異質性
基因表達在許多生物過程中呈現(xiàn)空間模式。然而這些模式很少是通過傳統(tǒng)bulkRNA-seq或經(jīng)典scRNA-seq發(fā)現(xiàn)的。在疾病發(fā)生發(fā)展中，空間異質性至關重要。同時研究病變組織中細胞類型及其定位迫切需要空間轉錄組。例如，在小鼠阿爾茨海默病（AD）模型中使用scRNA-seq，發(fā)現(xiàn)一種新的小膠質細胞類型與神經(jīng)退行性疾病相關。為了定位這些小膠質細胞，作者鑒定了標記物并使用smFISH來“照亮”它們。在該研究中，這些被激活的小膠質細胞特異性定位在AD斑塊附近，這表明這種細胞類型可能與AD起源密切相關，并為開發(fā)小膠質細胞激活藥物作為靶向治療策略提供了新思路。此外，在與大量表型變化相關疾病中，如癌癥，不同細胞的基因表達可能會有明顯差異以適應各自微環(huán)境。例如，Little等在病理標本中使用詳細的多色FISH技術研究膠質母細胞瘤，在幾乎沒有血管的區(qū)域觀察到癌細胞。而且這些細胞表現(xiàn)出表皮生長因子受體的轉錄擴增，而血小板衍生生長因子受體基因擴增的癌細胞則在內皮細胞附近富集。相比之下，基于LCM的方法適合于小樣本（如臨床樣本）和全轉錄組或基因組分析，因為其細胞吞吐量低，但它能實現(xiàn)全基因覆蓋和無偏見的細胞分離。
構建空間轉錄組圖譜
利用空間分辨的單細胞轉錄組學，在分子水平研究生命體結構的重要步驟是構建圖譜。因此美國國立衛(wèi)生研究院（NIH）將在未來7年內投入大量精力，開發(fā)一套史無前例的人類生物分子圖譜。美國國立衛(wèi)生研究院共同基金人類生物分子圖譜計劃（Human Biomolecular Atlas Program，HuBMAP）旨在通過支持技術開發(fā)、數(shù)據(jù)采集和精細空間定位，建立一個單細胞分辨率開放式圖譜框架。在小鼠中，除了基于MERFISH從小鼠大腦中下丘腦視前區(qū)110萬個細胞中繪制了轉錄組圖景外，Deisseroth等擴展了他們的STARmap方法，在6層完整的小鼠初級視覺皮層的30000多個細胞中研究了23個細胞類型marker的表達譜，以進一步研究完整大腦的三維復雜性。Zeisel等結合scRNA-seq和FISH揭示了小鼠神經(jīng)系統(tǒng)的分子結構。他們繪制了大腦各個區(qū)域的細胞圖譜，并提供了一個按區(qū)域劃分的基因表達圖景和一個用于下一步研究的參考圖譜。Asp等利用ST來研究人類心臟發(fā)育過程的時空基因表達譜。因此建立了一個跨越時間和空間的人類心臟發(fā)育圖譜。只有通過這些技術整合，提高細胞和基因的檢測通量，同時保留細胞空間環(huán)境信息，才有可能建立一個完整生命體結構的空間轉錄組圖譜。
描繪胚胎發(fā)育和空間藍圖
胚胎發(fā)育是一個復雜過程，其分子水平動態(tài)變化非常迅速。解析這種時間和空間維度的微變化一直是個挑戰(zhàn)。利用空間轉錄組技術有望實現(xiàn)構建胚胎發(fā)育的空間表達藍圖。在黑腹果蠅（D.melanogaster）與擬果蠅（D.Simulansbias）雜交胚胎發(fā)育過程中，即使與幾乎同一物種相比其基因調控也表現(xiàn)出空間差異?？臻g轉錄組學技術用于發(fā)現(xiàn)受空間調控的不同基因，最后分別鑒定了84個和39個具有黑腹果蠅和擬果蠅偏好的特異性表達的等位基因。此外，單個細胞內在的基因調控網(wǎng)絡可以與空間環(huán)境相互作用，從而確定細胞特性。例如，Zhu等開發(fā)了一種基于全局基因表達方法，能夠區(qū)分小鼠視皮層區(qū)域的細胞類型和空間域相關異質性。根據(jù)該方法，在谷氨酸能神經(jīng)元和星形膠質細胞小室中發(fā)現(xiàn)了明顯的空間相關而與細胞類型無關的信號。Shinozaki等利用LCM以及手動切割結合RNA-seq，確定了不同區(qū)域和不同成熟度番茄基因表達模式的空間差異。peng等通過整合時空信息，研究了小鼠早期胚胎中譜系分配（lineage allocation）和組織結構化（tissue organization）的分子架構，全面描繪了小鼠胚胎發(fā)育早期關鍵調控網(wǎng)絡。
五 未來展望
雖然空間轉錄組學在發(fā)現(xiàn)疾病因子、構建空間圖譜和繪制空間藍圖方面得到廣泛應用和推廣，但其潛力遠不止于此。例如在細胞間通訊研究中，不同細胞類型的環(huán)境相關互作是基于轉錄組數(shù)據(jù)和已知的配體-受體復合物推斷而來的。然而細胞之間正在進行的相互作用很難被瞬時捕捉。無論是在組織還是在培養(yǎng)環(huán)境中，緊密空間中細胞更容易相互作用，這正是空間轉錄組學的應用領域。將空間分辨轉錄組學引入細胞間通訊研究中非常值得期待。一些優(yōu)雅的實驗顯示了缺血神經(jīng)元的體細胞線粒體和軸突線粒體在單細胞尺度上的通訊。此外，scRNA-seq技術在許多方面促進了空間轉錄組學發(fā)展，例如提供細胞分型標記基因，這反過來又幫助scRNA-seq通過基因空間分布來區(qū)分亞群。此外，由于基于成像的方法，如seqFISH+、MERFISH和STARmap可以提供觀察單個細胞內分子行為的亞細胞視圖，因此分析基因間相互作用組、基因調控網(wǎng)絡和多模式組學成為可能。研究表明，DNA變異與mRNA表達有關，因此檢測分子的同時獲取其原始坐標可加深我們對轉錄因子如何激活基因表達、基因間如何相互溝通以及細胞如何運作的理解。突破這些瓶頸（懸而未決的問題）已成為未來前進方向。
下期預告：小編解析2020年8月20日發(fā)表于Cell的空間轉錄組研究阿爾茲海默癥（AD）文章。
參考文獻
1. Crosetto N, Bienko M, Van Oudenaarden A. Spatially resolved transcriptomics and beyond[J]. Nature Reviews Genetics, 2015, 16(1): 57-66.
2. Peng G, Suo S, Chen J, et al. Spatial transcriptome for the molecular annotation of lineage fates and cell identity in mid-gastrula mouse embryo[J]. Developmental cell, 2016, 36(6): 681-697.
3. Stahl P L, Salmén F, Vickovic S, et al. Visualization and analysis of gene expression in tissue sections by spatial transcriptomics[J]. Science, 2016, 353(6294): 78-82.
4. Chen J, Suo S, Tam P P L, et al. Spatial transcriptomic analysis of cryosectioned tissue samples with Geo-seq[J]. Nature protocols, 2017, 12(3): 566-580.
5. Chen X, Teichmann S A, Meyer K B. From tissues to cell types and back: single-cell gene expression analysis of tissue architecture[J]. Annual Review of Biomedical Data Science, 2018.
6. Thrane K, Eriksson H, Maaskola J, et al. Spatially resolved transcriptomics enables dissection of genetic heterogeneity in stage III cutaneous malignant melanoma[J]. Cancer research, 2018, 78(20): 5970-5979.
7. Peng G, Suo S, Cui G, et al. Molecular architecture of lineage allocation and tissue organization in early mouse embryo[J]. Nature, 2019, 572(7770): 528-532.
8. Stark R, Grzelak M, Hadfield J. RNA sequencing: the teenage years[J]. Nature Reviews Genetics, 2019, 20(11): 631-656.
9. Zhou Y, Jia E, Pan M, et al. Encoding Method of Single-cell Spatial Transcriptomics Sequencing[J]. International Journal of Biological Sciences, 2020, 16(14): 2663.
10. Moris N, Anlas K, van den Brink S C, et al. An in vitro model of early anteroposterior organization during human development[J]. Nature, 2020: 1-6.
11. Moor A E, Itzkovitz S. Spatial transcriptomics: paving the way for tissue-level systems biology[J]. Current opinion in biotechnology, 2017, 46: 126-133.
12. Ortiz C, Navarro J F, Jurek A, et al. Molecular atlas of the adult mouse brain[J]. Science Advances, 2020, 6(26): eabb3446.
13. Roth R, Kim S, Kim J, et al. Single-cell and spatial transcriptomics approaches of cardiovascular development and disease[J]. BMB reports, 2020.
14. Bingham G C, Lee F, Naba A, et al. Spatial-omics: Novel Approaches to Probe Cell Heterogeneity and Extracellular Matrix Biology[J]. Matrix Biology, 2020.
15. Lein E, Borm L E, Linnarsson S. The promise of spatial transcriptomics for neuroscience in the era of molecular cell typing[J]. Science, 2017, 358(6359): 64-69.
16. Saviano A, Henderson N C, Baumert T F. Single-cell genomics and spatial transcriptomics: discovery of novel cell states and cellular interactions in liver physiology and disease biology[J]. Journal of Hepatology, 2020.
17. Chen W T, Lu A, Craessaerts K, et al. Spatial Transcriptomics and In Situ Sequencing to Study Alzheimer’s Disease[J]. Cell, 2020.
18. Peng G, Cui G, Ke J, et al. Using Single-Cell and Spatial Transcriptomes to Understand Stem Cell Lineage Specification During Early Embryo Development[J]. Annual Review of Genomics and Human Genetics, 2020, 21.
19. Liao J, Lu X, Shao X, et al. Uncovering an Organ’s Molecular Architecture at Single-Cell Resolution by Spatially Resolved Transcriptomics[J]. Trends in Biotechnology, 2020.
