生信小課堂
影響因子：7.3
研究概述：作為最致命的乳腺癌亞型，三陰性乳腺癌（TNBC）是一種侵襲性極強的內分泌惡性腫瘤，復發率和遠處轉移率都很高。盡管化療和新輔助免疫療法在改善患者預后方面取得了進展，但許多患者仍會產生化療耐藥性。TNBC患者出現化療耐藥的可能性各不相同。一種推測認為，它與腫瘤微環境（TME）密切相關。與其他亞型相比，TNBC具有獨特的TME，為癌細胞與周圍的內皮細胞、免疫細胞和成纖維細胞相互作用創造了有利的環境，可刺激病情進展。作為T細胞的一個特殊亞群，T調節細胞（Tregs）可抑制抗腫瘤免疫反應，并通過抑制T細胞增殖和細胞因子的產生來防止自身免疫。TME浸潤的Tregs可通過激活免疫抑制和促腫瘤生成信號來創造免疫抑制環境，從而減少對化療和放療反應的影響。Tregs在TME中的潛在作用和Treg細胞的潛在治療靶點可能為TNBC的腫瘤免疫療法提供新的干預措施。本研究利用WGCNA確定了METABRICTNBC樣本中與Treg浸潤相關的模塊。隨后，根據與Treg浸潤相關的模塊建立了預后模型。隨后證明Treg浸潤相關基因模塊可用于建立TNBC進展的臨床相關分類。本研究揭示了TK1作為腫瘤生物標記物和免疫治療靶點的潛力。研究流程如下：
研究結果：
正常乳腺上皮細胞和TNBC組織的scRNA-seq分析
從GSE125449中提取并重新分析了21個樣本的scRNA-seq數據。在這些樣本中，13個來自正常乳腺組織，8個來自TNBC，基于細胞marker定義了六個細胞群（圖A）。為探索NKT細胞的異質性，作者將NKT細胞進一步分為5群（圖B）。由于Treg細胞有利于腫瘤抑制性微環境的形成，而腫瘤抑制性微環境會促進腫瘤進展并降低對免疫療法的反應，因此作者探討了腫瘤形成過程中Treg細胞浸潤的變化，發現與正常乳腺組織相比，Tregs在TNBC組織中的浸潤明顯增加（圖C、D）。
根據Treg浸潤對TNBC腫瘤進行分層
為了確定與Tregs浸潤相關的關鍵標記基因，作者使用CIBERSORT算法對Treg浸潤進行量化，并使用WGCNA檢測與Treg浸潤相關的基因模塊。在METABRIC隊列中發現了10個基因模塊，其中藍色基因模塊與Treg浸潤呈正相關，與患者生存狀態呈負相關（圖A）。利用METABRIC隊列中的生存數據和藍色模塊基因的表達值，作者使用單因素cox回歸使進行了生存分析，并確定了22個與Treg浸潤相關的預后基因，然后根據這22個基因的表達值對METABRIC隊列中的患者進行了無監督聚類（圖B）與主成分分析（圖C）。圖D熱圖顯示，這22個基因的表達模式在群組1和群組2之間存在差異。關聯臨床信息，與群組1相比，群組2患者的腫瘤分級、分期更高，生存狀況更差（圖E）。生存分析也顯示，Cluster2組的預后比Cluster1組差（圖F）。考慮到TNBC患者可能對多種化療藥物產生耐藥性，作者使用oncopredict包評估了這兩個群組對四種TNBC化療藥物的反應，發現群組1中的患者對這四種常見化療藥物更敏感（圖G）。
Treg浸潤相關預后模型的構建與驗證
為了促進Treg浸潤相關基因在預后中的臨床應用，作者采用了LASSO和RF兩種機器學習算法從所有22個Treg浸潤相關基因中分別篩選出17和13個關鍵基因，其中有7個交叉基因（圖A），多因素Cox回歸模型證明了其獨立危險性（圖B）。隨后作者構建了風險評分，將METABRIC隊列中的患者分為兩組，Treg浸潤相關風險評分較高的患者OS較差（圖C），時間ROC曲線也展示了其良好的預測性能（圖F），這些結果在兩個外部隊列（GSE58812和SCAN-B）中得到了驗證（圖D,E,G,H）。
高風險和低風險評分組免疫相關特征的差異
為了揭示各風險評分組在通路激活方面的差異，作者計算了基于KEGG通路基因集的GSVA評分。圖A表明高風險評分患者的代謝相關通路，而高風險評分患者的免疫相關通路的活化程度較低。此外，METABRIC隊列和SCAN-B的CIBERSORT算法結果顯示，與低風險評分患者相比，高風險評分患者的B細胞和CD8T細胞浸潤較低，但Treg細胞和M2-巨噬細胞浸潤較高（圖B）。有趣的是，高風險組的腫瘤突變負荷（TMB）水平低于低風險組（圖C）。此外，作者還發現了免疫檢查點表達在低風險組和高風險組之間的差異，顯示高風險組患者的免疫檢查點基因表達低于低風險組（圖D）。最后，作者計算了風險評分基因與免疫細胞浸潤之間的相關性，結果表明大多數基因與促進免疫治療反應的免疫細胞浸潤（B細胞、CD8T細胞）呈負相關，而與Treg細胞浸潤呈正相關（圖E）。
評估藥物和免疫療法反應
作者收集了一個包含TNBC患者免疫治療數據的數據集GSE173839。兔兔A表明免疫治療無反應者的風險評分高于免疫治療有反應者，圖B表明高風險評分組免疫治療失敗的患者比例高于低風險評分組。此外，ROC曲線分析表明，Treg浸潤相關風險評分在預測免疫治療反應性方面表現出色（圖C）。作者采用了使用CTRP和PRISM衍生的藥物反應數據來確定在Treg浸潤相關風險評分較高的患者中藥物敏感性較高的候選藥物。首先，在高Treg浸潤相關風險評分組和低Treg浸潤相關風險評分組之間進行差異藥物反應分析，以確定在高Treg浸潤相關風險評分組中估計AUC值較低的化合物（log2FC>0.10）。接下來，作者利用AUC值與Treg浸潤相關風險評分之間的斯皮爾曼相關系數，篩選出相關系數為負的化合物。這些分析得出了10種CTRP衍生化合物（包括SGX-523、DNMDP、tivozanib、AZD6482、BRD-K04800985、PLX-4720、MK-0752、MI-1、BRD-K33199242和TG-100-115）（圖Da）和4種PRISM衍生化合物（包括uprosertib、NVP-BEZ235、BAY-87-2243和temsirolimus）（圖Ea）。所有這些化合物在高Treg浸潤相關風險評分組的估計AUC值都較低，并且與Treg浸潤相關風險評分成反比（圖Db、Eb）。
諾曼圖建立和評估
為了提高上述風險評分的預測能力，將風險評分和腫瘤大小結合起來，利用多因素cox回歸分析建立了一個諾曼模型（圖A）。1年、2年、3年和5年的疾病特異性生存（DSS）校正曲線顯示，預測的生存概率與實際生存率一致，證明了該提名圖在預測生存方面的穩健性（圖A）。此外，作者還進行了DCA分析，結果顯示諾曼圖的預后價值優于單個變量的預后價值（圖A）。在訓練集和測試組中，諾曼圖預測的AUC均超過了風險評分（圖B-E）。
TK1是TNBC的關鍵風險評分因子和腫瘤促進因子
空間轉錄組分析結果顯示，TK1陽性表達的細胞主要定位于腫瘤細胞。此外，在TK1高表達的TNBC組織中，Treg細胞的浸潤也有所升高（圖A、B）。為了檢測TK1表達與Tregs之間的關系，作者采用Treg標記物FOXP3多重熒光染色法對31例TNBC患者進行了評估。不出所料，TK1的表達與Treg標記物FOXP3的表達狀態呈正相關（圖C-E）。這一結果表明，TK1表達較高的患者表現出更多的Treg浸潤。
隨后作者分析了TCGA泛癌癥隊列中TK1與Hallmark通路之間的關系。在多種癌癥類型中，TK1與細胞周期和增殖相關通路（如MYC靶點和MTORCI信號通路）呈正相關（圖A）。同時作者分析了TCGA隊列中20種癌癥類型的腫瘤和正常組織中TK1的表達情況；70%的腫瘤中TK1上調，包括BLCA、UCEC、HNSC、PRAD、KIRP、COAD、LUSC、KIRC、LIHC、BRCA、THCA、LUAD、CHOL、ESCA和STAD（圖B）。生存分析表明，TK1的高表達與10多種癌癥較差的預后相關（圖C）。
為了驗證TK1在TNBC中作為風險評分的關鍵角色以及腫瘤啟動子的作用，作者進行了幾項功能實驗來檢測對照組和siRNA介導敲除組的遷移、侵襲和增殖能力。HPA數據庫顯示，TK1在癌癥組織中高表達（圖A）。為了探索TK1在體外TNBC增殖和遷移中的作用，研究人員采用瞬時轉染靶向TK1的方法抑制其表達（si-TK1-1和si-TK1-2）。TK1敲除后，TNBC細胞的遷移、侵襲和增殖能力下降，差異有統計學意義。與對照組相比，CCK-8（圖D）和集落形成實驗（圖E）結果顯示，沉默TK1分別顯著降低了TNBC細胞的活力和增殖能力。此外，傷口愈合試驗和Transwell試驗的結果也顯示，與對照組相比，TK1敲除后細胞的遷移能力下降（圖C、F）。總之，這些發現共同證實了TK1能促進TNBC細胞的增殖和遷移。
研究總結：
在這項研究中，作者證明了TNBC中的Treg浸潤相關基因可用于建立與臨床相關的TNBC分類。基于三個TNBC隊列，開發并驗證了與Treg浸潤相關的預后模型，確定了Treg浸潤相關基因在腫瘤免疫微環境的發展和免疫治療反應中的作用。此外，作者還發現與Treg浸潤相關的風險評分呈負相關且藥物敏感性較高的候選藥物，它們可以預測TNBC的臨床結果和免疫治療反應。最終，作者通過表型實驗驗證Tregs可能通過調節TME內TK1的表達來影響腫瘤的發生、發展和預后。最終得出結論：Treg浸潤相關預后模型可以拓寬我們對TNBC生物學和預后預測的理解，靶向Tregs是治療TNBC的一種很有前景的方法。
