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研究概述：
三陰性乳腺癌(TNBC)是一種侵襲性、致命性的惡性腫瘤。本研究著眼于激活抗腫瘤反應(yīng)所必需的中間T細(xì)胞亞群和腫瘤微環(huán)境，旨在開發(fā)為TNBC患者量身定制的免疫治療方法。
作者從GEO數(shù)據(jù)庫(kù)中獲取TNBC的scRNA-seq數(shù)據(jù)，采用多重策略分析和鑒定TNBC的T細(xì)胞異質(zhì)性，重點(diǎn)研究CD8+和CD4+這2種T細(xì)胞亞型，通過(guò)結(jié)合METABRIC和GEO數(shù)據(jù)庫(kù)，構(gòu)建并驗(yàn)證了T細(xì)胞標(biāo)記基因的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型。最后使用CIBERSORT分析TNBC的免疫浸潤(rùn)細(xì)胞，并探討風(fēng)險(xiǎn)模型與免疫治療反應(yīng)之間的關(guān)系。
流程圖：
研究結(jié)果：
一、TNBC的細(xì)胞構(gòu)成
- （圖2A）本研究共納入10個(gè)TNBC單細(xì)胞樣品。
（圖2B）去除低質(zhì)量細(xì)胞、歸一化、整合和PCA后，將25932個(gè)細(xì)胞分為14個(gè)簇。
（圖 2C）通過(guò)注釋這些亞簇鑒定出7種細(xì)胞類型：內(nèi)皮細(xì)胞（簇 12）、上皮細(xì)胞（簇 0、4、8）、組織干細(xì)胞（簇 6、13）、B 細(xì)胞（簇 7、10、14）、T 細(xì)胞（簇 1、2、5、11）、巨噬細(xì)胞（簇 3）和單核細(xì)胞（簇 9）。
2. 圖D顯示了不同樣品中存在的細(xì)胞類型。圖E-G顯示了每種細(xì)胞類型的重要標(biāo)記基因。
- （圖3）根據(jù)文獻(xiàn)中列出的標(biāo)記基因，對(duì)獲得的T細(xì)胞亞群分類和鑒定:
（1）CD4 T細(xì)胞高表達(dá)IL7R、FOXP3、CCR7（簇1、2、3、5、6、7、13、14、16、17）;
（2）CD8 T細(xì)胞高表達(dá)GZMH、CD8B、CD8A（簇0、4、8、9、10、11、12、15）。
二、與 T 細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞間相互作用分析
1. 圖4利用Cellchat檢測(cè)配體-受體對(duì)以及不同細(xì)胞之間的分子相互作用。
- 配體-受體介導(dǎo)的細(xì)胞相互作用主要存在于MIF信號(hào)通路(MIF-CD74+CXCR4和MIF-CD74+ CD44)中(圖D)。其中，配體-受體對(duì)MIF-CD74+CXCR4對(duì)該通路中貢獻(xiàn)最大(圖E)。ACKR3和CXCR2的基因表達(dá)也與該信號(hào)通路相關(guān)(圖F)。
三、T細(xì)胞的軌跡
1. Monocle 2進(jìn)行T細(xì)胞的偽時(shí)序分析，大致有7種分化狀態(tài)，不同狀態(tài)下2種亞型的含量不同。結(jié)果顯示，T細(xì)胞分化為CD4+細(xì)胞和CD8+細(xì)胞(圖5A)。
2. 隨發(fā)育時(shí)間變化，基因分為4個(gè)簇，分別與淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫、蛋白折疊、免疫球蛋白和細(xì)胞質(zhì)翻譯相關(guān)(圖5B)。圖5C顯示了6個(gè)T細(xì)胞標(biāo)記基因的動(dòng)態(tài)表達(dá)，可以看出它們的表達(dá)在不同的分化時(shí)期有所不同。
四、GO，KEGG和GSEA富集分析以闡明T細(xì)胞中標(biāo)記基因的生物學(xué)功能
1.（圖6A）GO富集結(jié)果表明，生物過(guò)程（BP）主要與細(xì)胞質(zhì)翻譯、抗原加工和呈遞、T細(xì)胞活化調(diào)控、肽酶活性調(diào)節(jié)和白細(xì)胞-細(xì)胞粘附有關(guān)。
細(xì)胞成分（CC）主要與局灶黏附、基底細(xì)胞連接、細(xì)胞質(zhì)核糖體、核糖體和核糖體亞基有關(guān)。
分子功能（MF）與核糖體的結(jié)構(gòu)成分、鈣調(diào)蛋白結(jié)合、MHC II類蛋白復(fù)合物結(jié)合、MHC蛋白復(fù)合物結(jié)合和未折疊蛋白結(jié)合有關(guān)。
2. （圖6B）KEGG結(jié)果表明，標(biāo)記基因主要富集在T細(xì)胞活化發(fā)揮作用的通路中，包括Th1、Th2和Th17細(xì)胞分化、細(xì)胞粘附分子、T細(xì)胞受體信號(hào)通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架和PD-L1表達(dá)調(diào)控以及PD-1檢查點(diǎn)信號(hào)通路。
3.（圖6C）GSEA結(jié)果還涉及了T細(xì)胞受體信號(hào)通路。
五、預(yù)后模型的構(gòu)建與驗(yàn)證
從單細(xì)胞數(shù)據(jù)中選擇1299個(gè)標(biāo)記基因的T細(xì)胞與METABRIC數(shù)據(jù)集的TNBC表達(dá)矩陣相交。隨后，單變量Cox回歸分析了METABRIC隊(duì)列中106個(gè)潛在預(yù)后基因，之后進(jìn)行Lasso和多變量Cox回歸分析，確定4個(gè)基因（OPTN，TMEM176A，PKM和HES1）為獨(dú)立的預(yù)后基因。
將TNBC患者分為低危或高危組，在訓(xùn)練隊(duì)列（METABRIC）和測(cè)試隊(duì)列（GSE58812）中，高危組患者的預(yù)后都較差。此外，ROC曲線顯示，訓(xùn)練隊(duì)列（圖7A）的AUC為>0.7，測(cè)試隊(duì)列（圖7B）的AUC為>0.65，表明四個(gè)預(yù)后基因是TNBC患者OS的較好預(yù)測(cè)因素。
六、TNBC與免疫細(xì)胞浸潤(rùn)及免疫檢查點(diǎn)的相關(guān)性
1. 基于METABRIC數(shù)據(jù)集，使用CIBERSORT算法分析腫瘤浸潤(rùn)免疫亞群的比例，并在TNBC樣本中構(gòu)建了22個(gè)免疫細(xì)胞譜(圖8A)。
2. 使用Estimate R包評(píng)估高危組和低危組患者的TME。免疫評(píng)分，基質(zhì)評(píng)分或ESTIMATE 評(píng)分越高，TME中免疫或基質(zhì)成分越多。本研究中，低危組的免疫評(píng)分、基質(zhì)評(píng)分和ESTIMATE評(píng)分較高，腫瘤純度評(píng)分較低，表明低危組TNBC患者的腫瘤比例較低（圖8B）。
3. （圖8C）免疫細(xì)胞的浸潤(rùn)水平分析表明，T細(xì)胞CD8、幼稚T細(xì)胞、CD4記憶活化T細(xì)胞和T細(xì)胞γδ在低危組表達(dá)較高，而T細(xì)胞濾泡輔助細(xì)胞和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs）在高危組表達(dá)較高。另外，低危組中的靜息樹突狀細(xì)胞和靜息NK細(xì)胞與TNBC患者的生存預(yù)后不良有關(guān)。
5. （圖8D）免疫檢查點(diǎn)差異分析表明，B2M、CD8A、CD40、CD40LG、ICOS、IFNG、IL23A和PTPRC在低危組中表達(dá)較高，與TNBC患者生存預(yù)后不良相關(guān)。
研究總結(jié)：
本研究首先闡明了TNBC中T細(xì)胞在功能富集、細(xì)胞分化軌跡和細(xì)胞間通訊方面的異質(zhì)性，并將OPTN、TMEM176A、PKM和HES1確定為獨(dú)立的預(yù)后基因，該模型有助于預(yù)測(cè)乳腺癌的預(yù)后和對(duì)治療的反應(yīng)，為了解TNBC的T細(xì)胞異質(zhì)性和相關(guān)預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)模型提供了資源。
