影響因子：7.3
研究概述：作為血管炎的主要亞群，抗中性粒細(xì)胞胞漿抗體相關(guān)血管炎（AAV）是一種相對(duì)罕見的自身免疫性疾病，影響腎臟功能。由AAV引起的腎小球腎炎稱為ANCA相關(guān)性腎小球腎炎(ANCA-GN)。NETs（中性粒細(xì)胞胞外核外陷阱）NET可能參與AAV的發(fā)生和發(fā)展。當(dāng)AAV中的核染色體作為NETs從細(xì)胞的外層空間擠出時(shí)，它可以誘發(fā)一種新型的細(xì)胞死亡，稱為NETosis。本研究中，加權(quán)基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)分析（WGCNA）用于識(shí)別與ANCA-GN中臨床性狀相關(guān)的模塊，與NETs相關(guān)基因相交，并識(shí)別差異表達(dá)的NETs（DE-NETs）。DE-NET用于構(gòu)建NETosisScore模型，該模型用于將樣本分為高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組。探索了這些群體的基因表達(dá)、免疫微環(huán)境和生物功能。通過三種機(jī)器學(xué)習(xí)方法篩選了NETosis相關(guān)基因（NRG），并探索了其潛在的生物功能、免疫細(xì)胞入侵和臨床價(jià)值。QPCR在ANCA-GN患者的全血樣本中驗(yàn)證了大多數(shù)NRG的差異表達(dá)，為干預(yù)提供了新的見解。
目前最新的機(jī)器學(xué)習(xí)思路是使用100多種機(jī)器學(xué)習(xí)組合進(jìn)行建模或者篩選關(guān)鍵基因，這種方法在腫瘤中已經(jīng)發(fā)表多篇1區(qū)文章，例如
**[最新1區(qū)8+純生信，結(jié)合10種機(jī)器學(xué)習(xí)算法構(gòu)建模型，換個(gè)腫瘤可重復(fù)！]
如果這種思路在非腫瘤中使用，勢必會(huì)給文章提高檔次！
研究結(jié)果：
流程圖
一、WGCNA構(gòu)建和hub模塊識(shí)別
作者將兩個(gè)數(shù)據(jù)集GSE108109和GSE104948合并為一個(gè)隊(duì)列進(jìn)行進(jìn)一步分析，選擇了β = 9（無尺度R2 = 0.9）的軟閾值（圖2A），密切相關(guān)的模塊使用0.25的聚類高度閾值進(jìn)行合并，并顯示在聚類樹下方（圖2B），確定了與ANCA-GN相關(guān)的三個(gè)模塊（圖2C）。這三個(gè)模塊中的基因與已知的NETs基因集相交，黃色模塊與NETs的交集最多（圖2E），發(fā)現(xiàn)黃色模塊和ANCA-GN組之間存在顯著的正相關(guān)性。此外，根據(jù)黃色模塊中的散點(diǎn)圖，GS和MM之間也發(fā)現(xiàn)了顯著的相關(guān)性（圖2D）。因此，黃色模塊被確定為與ANCA-GN的NETosis最相關(guān)的模塊。從圖2F可以看出，ANCA-GN和對(duì)照組之間的差異，最后，18個(gè)DE-NET被納入了研究。
二、DE-NET的功能分析
GO富集分析中，“白細(xì)胞介素-6生產(chǎn)的積極調(diào)節(jié)”、“細(xì)胞因子生產(chǎn)的積極調(diào)節(jié)”和“白細(xì)胞介素-8生產(chǎn)的積極調(diào)節(jié)”主要富集在生物過程（BP）中，白細(xì)胞介素-8主要富集在生物過程中（BP），“分泌顆粒膜”、“三級(jí)顆粒”和“富集ficolin?1?的顆粒”主要富集于細(xì)胞組成中（CC），而“水解酶活性主要富集在分子功能（MF）中（圖3A）。在KEGG富集分析中，“中性粒細(xì)胞胞外陷阱形成”、“toll樣受體信號(hào)通路”和“金黃色葡萄球菌感染”主要富集（圖3B），這表明炎癥因子產(chǎn)生和toll樣受體信號(hào)通路可能參與ANCA-GN中NETosis的形成。
三、NETosisScore模型的構(gòu)建和驗(yàn)證
基于18DE-NET的ssGSEA得分中位數(shù)構(gòu)建了NETosis評(píng)分（NETosisScore），64名患者被分為高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)組（圖4A）。通過主成分分析（PCA）可以清楚地區(qū)分高風(fēng)險(xiǎn)和低風(fēng)險(xiǎn)群體之間的分布（圖4B）。從兩組的NETosisScore分布圖中可以看出，隨著評(píng)分的增加，高風(fēng)險(xiǎn)組的患者數(shù)量逐漸增加（圖4C）。所有DE-NET在高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間都有顯著的差異表達(dá)（圖4D）。NETosisScore可以顯著區(qū)分正常對(duì)照組和ANCA-GN患者（p=2.3e-10），與正常對(duì)照組相比，ANCA-GN患者的NETosisScore更高（圖4E）；訓(xùn)練集中NETosisScore的ROC曲線下的面積為0.920（p<0.001）（圖4H）。在E-MTAB-1994集（p=0.003）和GSE104954集（p=0.00017）（圖4G）中，ANCA-GN組的NETosisScore不僅在統(tǒng)計(jì)學(xué)上明顯高于對(duì)照組，而且在E-MTAB-1994集（p<0.001）中發(fā)現(xiàn)ROC曲線的面積為0.797（圖4I）和GSE104954集（圖4J）為0.825。
四、兩種NETosisScore亞型的免疫學(xué)特征和生物途徑
作者比較了高風(fēng)險(xiǎn)組和低風(fēng)險(xiǎn)組之間的免疫細(xì)胞浸潤豐度，與低風(fēng)險(xiǎn)組相比，高風(fēng)險(xiǎn)組的免疫細(xì)胞浸潤量更高。激活的CD4 T細(xì)胞、中央CD4記憶T細(xì)胞和效應(yīng)CD4記憶T細(xì)胞在兩個(gè)亞組中都有顯著的差異表達(dá)，高危組的水平較高（圖5A），NETosisScore與幾個(gè)CD4 T細(xì)胞呈正相關(guān)（圖5B）。Treg細(xì)胞在高危NETosisScore組中表現(xiàn)出最顯著的相關(guān)性和最高的相關(guān)系數(shù)（圖5C）。
在高風(fēng)險(xiǎn)組中，主要是細(xì)胞對(duì)生物刺激、白細(xì)胞介素-6產(chǎn)生、白細(xì)胞遷移和吞噬作用的反應(yīng)（圖5D），而在低風(fēng)險(xiǎn)組中，主要是α氨基酸代謝、單羧酸分解代謝和有機(jī)酸分解代謝（圖5E）。B細(xì)胞受體信號(hào)通路、細(xì)胞因子-細(xì)胞因子受體相互作用、Toll樣受體信號(hào)通路和NOD樣受體信號(hào)通路在高風(fēng)險(xiǎn)組中富集，而其他途徑，如賴氨酸降解、組氨酸代謝和脂肪酸代謝，在低風(fēng)險(xiǎn)組中更集中（圖5F）。
五、NETosis相關(guān)基因的鑒定
作者使用SVM-RFE算法根據(jù)18個(gè)DE-NET篩選出8個(gè)基因（圖6A，B）。接下來應(yīng)用隨機(jī)森林樹算法來識(shí)別七個(gè)基因（圖6C，D），Lasso回歸確定了10個(gè)NRG（圖6E，F(xiàn)）。隨后，三種機(jī)器學(xué)習(xí)算法的結(jié)果取交集，最后六個(gè)重要基因被確定為ANCA-GN潛在生物標(biāo)志物的NRG（CYBB、ITGB2、ITGAM、TLR2、TLR7和LILRB2）（圖6G）。
六、NRGs的免疫特性和相互作用功能分析
使用28種免疫細(xì)胞浸潤或免疫反應(yīng)來探索ANCA-GN組和對(duì)照組之間的免疫特征差異（圖7A），ANCA-GN組的CCR、巨噬細(xì)胞、T細(xì)胞抑制和TIL水平明顯高于健康對(duì)照組（圖7B）。
通過GO/KEGG富集對(duì)26個(gè)相關(guān)基因分析，富集的生物過程（BP）包括調(diào)節(jié)白細(xì)胞介素-8的產(chǎn)生和調(diào)節(jié)白細(xì)胞細(xì)胞介素-6的產(chǎn)生，以及細(xì)胞對(duì)生物刺激的反應(yīng)。最富集的細(xì)胞成分（CC）是分泌顆粒膜、質(zhì)膜組成部分和三級(jí)顆粒。分子功能（MF）類別富含肽結(jié)合、DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性的正調(diào)控以及以氧為受體作用于NAD（P）H的氧化還原酶活性（圖7D）。KEGG分析顯示，toll樣受體信號(hào)通路、模式識(shí)別受體信號(hào)通路和NIK/NFκB信號(hào)通路主要富集（圖7E）。
七、線譜圖的構(gòu)建和臨床腎功能分析
基于訓(xùn)練集（GSE104948和GSE108109）中6個(gè)NRG（CYBB、ITGB2、ITGAM、TLR2、TLR7和LILRB2）的表達(dá)水平構(gòu)建了ANCA-GN的臨床診斷模型（圖8A）。校準(zhǔn)曲線顯示了ANCA-GN的實(shí)際風(fēng)險(xiǎn)和預(yù)測風(fēng)險(xiǎn)之間的最小差異（圖8B）。DCA表明，當(dāng)DCA曲線的高風(fēng)險(xiǎn)閾值為0-1時(shí)，該模型明顯高于其他單個(gè)NRG（圖8C）。ROC曲線顯示，模型曲線（AUC）下的面積約為0.984，高于任何其他單個(gè)基因的AUC（圖8D）。校準(zhǔn)曲線、DCA曲線分析和模型ROC曲線的AUC結(jié)果與訓(xùn)練數(shù)據(jù)集一致（圖8E-G）。
Spearman相關(guān)分析顯示，隨著腎功能的下降，6個(gè)NRG的表達(dá)水平增加，所有NRG都與GFR呈正相關(guān)。TLR2和GFR之間發(fā)現(xiàn)了最強(qiáng)的相關(guān)性（圖8H）。所有6個(gè)NRG都與Scr水平呈負(fù)相關(guān)（圖8I）。
八、NRG的獨(dú)立數(shù)據(jù)集驗(yàn)證
進(jìn)行獨(dú)立數(shù)據(jù)集驗(yàn)證，在GSE104954（p<0.001）（圖9A）和E-MTAB-1944（p<0.001）（圖9B）中檢測到了六個(gè)NRG的差異表達(dá)。在訓(xùn)練數(shù)據(jù)集中，所有NRG都表現(xiàn)出高水平的診斷準(zhǔn)確性，如ROC曲線（AUC）下的區(qū)域所示，這些區(qū)域都大于0.90（圖9C-H）。
九、qPCR和免疫組織化學(xué)染色
qPCR結(jié)果表明，除ITGB2外，與健康對(duì)照組相比，ANCA-GN患者的所有NRG都明顯過度表達(dá)，ANCA-GN組和健康組之間的表達(dá)水平在統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著（圖10A-F）。
對(duì)ANCA-GN患者和腎透明細(xì)胞癌患者鄰近腎組織中腎組織中NRG的免疫組織化學(xué)染色（圖10G），證實(shí)NRG在ANCA-GN中明顯過度表達(dá)，可能在ANCA-GN中發(fā)揮重要作用。
研究總結(jié)：本研究通過全面的生物信息學(xué)分析系統(tǒng)地探索了ANCA-GN的潛在機(jī)制。與此同時(shí)，這項(xiàng)研究還篩選了一些關(guān)鍵基因和重要通路，這可能有助于在ANCA-GN中找到新的生物標(biāo)志物或治療靶點(diǎn)。為了更有針對(duì)性地探索ANCA-GN的病理生理機(jī)制，還需要進(jìn)一步的動(dòng)物和臨床分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證這項(xiàng)研究的結(jié)果。
