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Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine
導讀：在過去的10年里，單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術的進步對生物醫學研究產生了革命性的影響，使單細胞轉錄組分析的分辨率和吞吐量達到前所未有的水平（先籠統的說單細胞轉錄組技術在過去產生的影響以及實現的水平，接下來開始整體具體陳述其應用-4點（細胞水平分析與Zoom in比較）。具體來說，scRNA-seq促進了新細胞或罕見細胞類型的鑒定，單細胞軌跡構建和干細胞或祖細胞分化的分析，以及在單細胞分辨率下健康和疾病相關組織的比較。（描述了單細胞轉錄組在整體具體上的作用，研究人員又開始闡述在心血管領域中的具體作用）在過去的十年中，這些應用已經在心血管研究的進展中發揮了關鍵作用，證明了哺乳動物心臟和血管細胞圖集的生成，闡明了心血管發育和干細胞或祖細胞分化的機制。在本文中，研究人員總結了目前可用的scRNA-seq技術和分析工具，并討論了使用scRNA-seq的最新發現，這些發現極大地提高了我們對心血管系統的發展和心血管疾病的機制的認識。此外，研究人員還研究了整合多模式單細胞平臺的新興策略，重點關注未來在心血管精準醫學中的應用，即使用單細胞組學方法來表征細胞對藥物或環境刺激的特異性反應，并開發有效的患者特異性治療方法（重點闡明三點）。
論文ID
原名：Single-cell RNA sequencing in cardiovascular development, disease and medicine
期刊：Nature Reviews /Cardiology
IF：20.26
發表時間：202008
通訊研究人員：Joseph C. Wu
通訊研究人員單位：斯坦福大學心血管學院
DOI號：10.1038/s41569-020-0359-y??
實驗設計
介紹
傳統的bulk測序技術與PCR等技術檢測的是細胞群體水平的基因平均表達情況，這可能在高異質性細胞群與轉錄組差異的研究中產生誤解。采用熒光激活細胞分選法或共軛磁珠輔助法可以基于細胞膜表面蛋白與靶細胞群體進行分選。雖然這些方法確實產生了重要的發現，但它們是費力和昂貴的，并且不能完全識別細胞異質性的完整圖譜，并留下一些未描述的細胞亞群。單細胞轉錄組測序的產生實現了從平均到每個細胞獨特的Zoom in，能夠揭示細胞群的異質性與新的細胞狀態以及闡述細胞分化與發育中的動態轉變，對于心血管疾病的研究具有重要作用。
接著，作者介紹了單細胞轉錄組在細胞水平中的具體應用。器官圖譜的產生對于器官特定功能的了解具有重要作用。由于scRNA-seq能夠交叉分析給定樣本中多種細胞類型的單細胞轉錄組，因此也可以根據基因表達預測通過配體-受體結合的細胞間通訊。這些類型的分析預計將進一步補充空間轉錄組學的進展。重要的是，單細胞基因組學、轉錄組學、表觀基因組學和蛋白質組學的結合將是評估細胞群體異質性及其對患者特異性藥物反應和不良反應的貢獻的關鍵。
在本篇綜述中，研究人員探討了scRNA-seq的實驗流程和應用，討論了相關的數據分析策略，并總結了心血管研究中使用scRNA-seq發表的研究成果。此外，我們還描述了整合多模式單細胞組學平臺的潛力，這有望提高我們探尋心血管領域知識缺口的能力，并加速精準醫學的進步。
結果
單細胞RNA測序技術
在過去的10年里，各種單細胞方法已經發展起來，它們有不同的方法來捕獲和擴增細胞，以及mRNA轉錄長度、捕獲的靶細胞數量和每個細胞讀取深度的差異。每種方法各有優缺點，但是單細胞轉錄組測序分析有一套共有流程。
單細胞制備的主要挑戰包括起始樣品的脆弱性、物理壓力、緩沖液的選擇、細胞解離時間和單細胞產量。最小的處理，同時保持樣本完整性和實驗和運行之間的標準化是減少數據可變性的關鍵。操作時間的減少減少了人為錯誤，提高了數據的一致性和質量。對于基于微滴的scRNA-seq，在捕獲單細胞之前需要準備單細胞的活種群，并且必須消除細胞聚集或聚集、死細胞碎片和自由漂浮的mRNA。
質控與均一化
當單細胞捕獲、文庫準備和測序完成后，讀取比對可以應用于原始測序數據，使用通用RNA-seq讀取比對器STAR，利用公共平臺(如10x Genomics的Cell Ranger)生成特征條形碼矩陣。Cell Ranger也可以過濾和計數條形碼和獨特的分子識別器以及標準化數據從多個實驗達到相同的測序深度。其他預處理管道，如dropEst、Dr.seq2和scPipe，也可用于生成表達矩陣?，F有的用于Bulk RNA-seq數據的工具，如FastQC或RNA-SeQC，可以用于處理scRNA-seq數據。詳細的質量控制和標準化方法以前已經發表過。
比對后，可以使用大量的R包或python包進行數據的質量控制、可視化和分析。迄今為止，Monocle39、Scanpy40、Scater41、Scell42、Seurat43和sina44軟件包是用戶驅動的、無監督的單細胞基因表達分析最常用的軟件包。使用Seurat，各種質量控制參數，如線粒體基因百分比，總基因計數和每個細胞的唯一分子標識數，可以被可視化。為下游分析這些參數的閾值。值得注意的是，與所有其他細胞類型(5-20%)相比，心肌細胞具有異常高的線粒體基因含量(占總轉錄本的58 -86%)。
降維
scRNA-seq數據的多維特性，即單維表示單個基因的表達，必須降低其可解釋的可視化和分析。到目前為止，各種各樣的降維算法和無監督聚類已經被開發出來。在為感興趣的數據集選擇最優算法時，必須考慮計算和生物學上的優缺點，因為沒有一種單一的方法被認為是金標準。關于不同算法的差異和具體性質的更多細節已經在之前發表過。
隨著基于液滴的scRNA-seq的出現，數據集的大小越來越大，現在產生了更多的細胞捕獲，提供更大的能力并提高了識別罕見細胞群的能力。此外，線性變換，如主成分分析(PCA)，由于高水平的dropout和噪音46，不能捕捉細胞關系。非線性降維算法，如t分布隨機鄰居嵌入(t-SNE)47和一致流形近似和投影(UMAP)48，由于其靈活性和生成可視可解釋結果的能力，因此變得越來越受歡迎。
因此，公開可用的包可允許從用戶定義的PCAs從t-SNE和UMAP進行投射和可視化。非線性降維的分辨率，即k-means值（由大往小調，先細分群，再粗分群），可由用戶設置和調整。單個的k-means值或分辨率與產生的簇的數量直接相關，不可能是完全正確的，這需要研究者從生物學和生理學的角度來驗證從選擇的分辨率得到的簇的數量和類型是否確實有效。
數據分析
未監督細胞群分類：與傳統的bulk分析相比，scRNA-seq的一個顯著優勢是識別和描述給定樣本中存在的異質細胞群。從生物學角度來看，心臟中的細胞群代表不同的細胞類型，如心肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和免疫細胞，但它們也可以代表相同細胞類型的不同功能狀態，如心室、心房或起搏器心肌細胞，或血管生成細胞與靜止內皮細胞。因此，非監督的聚類方法必須執行來定義細胞群，并以經驗來確認由數學聚類定義的細胞群是否確實代表生物學上相關的或正確的細胞類型或狀態。
在單細胞研究中，監督聚類指的是機器學習方法，它指示一個細胞是否屬于基于典型的細胞-簇對的聚類。例如，MetaNeighbor允許用戶評估細胞類型特異性轉錄特征如何在獨立的數據集上重復49。相反地，無監督聚類是涉及到數據本身的結構的機器學習，而不需要其他數據集的任何干預。
許多基于機器學習算法的聚類策略已經建立起來50。一種流行的策略是k-means方法，它迭代地確定每個細胞被分配到的最近的k簇中心。這種策略是無監督聚類的一個例子，因為聚類的數量k是一個由用戶任意定義的參數，而不是從以前的任何數據集學習到的。該方法一般是在特征選擇和降維后使用，不需要很大的計算能力。k-means方法的主要缺點是，它假設一個預定數量的圓形，同樣大小的集群，這當違反時，會導致無法檢測到可能的稀有細胞群。
另一種廣泛使用的方法是分層聚類，它將單個細胞組合成更大的聚類或者把群分成更小的亞群。該策略包括使用歐幾里得距離等測量值計算單元之間的距離。層次聚類方法比k均值慢，但允許識別不同粒度的聚類之間的關系。層次聚類方法包括通過imputation（歸責）和dimensionality（維度）、pcaReduce52和sincere進行聚類。
圖聚類是第三種方法，涉及基于社區檢測的算法，廣泛用于分析更大的數據集。社區檢測方法的優勢在于它可以擴展到數百萬個細胞。Louvain算法是目前最流行的用于scRNA-seq數據分析的社區檢測算法之一46。這種方法首先將每個獨立的單元作為獨立的集群處理，然后以逐步的方式執行模塊化優化。對于每個單元，算法檢查是否可以通過將該單元從當前的集群移動到另一個集群來增加網絡模塊化。隨后，屬于同一簇的細胞被聚集為超級細胞形成一個新的網絡。迭代地重復這兩個步驟，直到不能進一步增加模塊化為止。利用PhenoGraph53和Seurat43方法可以實現Louvain算法。其他獨立的無監督聚類方法包括貝葉斯信息準則和Akaike信息準則，它們可以用來估計最優的聚類數量54。
譜系重建
細胞軌跡分析工具使細胞譜系的時間順序或生物的種群在開發過程中從多個時間點的細胞或干細胞或祖細胞分化擬時間的概念,一個標量測量細胞的長時間在無監督manner55鋪平了道路。在過去的5 - 6年里，基于降維、最近鄰圖、簇網絡和RNA速度的四種主要的譜系重建算法被開發出來。每一種方法的計算和生物學細節，以及單細胞轉錄組學和遺傳譜系追蹤的結合如何促進我們對發育、組織穩態和疾病的理解，之前已經描述過56。譜系重建工具在描述冠狀動脈發育57、第一和第二心臟場祖細胞規范58以及涉及人類心臟發育的所有主要細胞類型的基因表達變化方面特別有用。
在過去的一年中,譜系追蹤超出基于表達的計算重建已經成為可能,通過跟蹤體細胞突變線粒體DNA (mtDNA),使用scRNA-seq或類似的方法來評估染色質易訪問性如單細胞分析轉錄酶可及性染色質使用測序（scATAC-seq) 。mtDNA的突變率通常比核DNA高10- 100倍，許多研究人員利用這一差異證明，mtDNA突變的積累可以作為內源性遺傳條形碼，在體外和體內追蹤細胞譜系。mtDNA序列變化已被跟蹤，以重建造血細胞和實體瘤的克隆混合物中的細胞關系。與核基因組測序相比，這種方法使克隆追蹤規模增加了1000倍。一種基于scATAC-seq(內源性突變的表觀基因組和線粒體條形碼譜系，或徽章)形成的類似方法同時被開發出來，以促進急性髓系白血病患者造血干細胞及其后代的克隆進化分析60。這些單細胞方法補充了現有的遺傳譜系追蹤技術，并將克隆追蹤研究擴展到任何真核生物的任何細胞或組織類型，包括人類心血管組織。
細胞內相互作用的預測
使用傳統的Bulk分析工具幾乎不可能在不同的細胞和組織類型之間分析和解釋旁分泌信號通路。分析scRNA-seq數據的信息學工具的發展提供了研究細胞間通信和信號傳遞的一個有前途的解決方案。例如，在現有的人類數據庫的基礎上，已經建立了一份2000對小鼠配體受體對的清單，用于分析成年小鼠心臟每種細胞類型中配體受體對的表達模式。令人驚訝的是，分析顯示在非心肌細胞群體中存在著密集的通訊網絡;心臟成纖維細胞被認為是最有營養的細胞群，具有密切的多細胞連接，支持特定的鄰近細胞群的生存。在胎鼠心臟中，通過細胞間通訊分析，確定心外分泌和心內膜分泌的旁分泌因子，這些因子在心臟形成過程中調節心肌細胞增殖和小梁向致密心肌的過渡。內皮細胞分化的人誘導多能干細胞(iPSCs)的scRNA-seq同樣揭示了分化過程中產生的多種細胞類型之間廣泛的細胞間相互作用和分子間的相互作用。然而，這些相互作用網絡并沒有考慮細胞類型的實際解剖位置或邊界，也沒有提供細胞串擾的確切證據（缺點）。應對相應的生物樣品進行足夠的體內或體外實驗，包括但不限于FACS、免疫組化、原位雜交或酶聯免疫吸附試驗(ELISA)，以驗證生信細胞類型鑒定和配體受體對預測分析。然而，上述工具對于大規模、無監督地預測異質細胞群中的多細胞信號通路是非常強大的。因此，使用scRNA-seq的細胞間通信預測分析可以補充各種正交方法(如蛋白質組學)和成像模式，以發現和闡明細胞串話的新機制。
[if !supportLists]2.?[endif]生成心血管細胞圖譜
心臟發育
scRNA-seq已被用于廣泛的心血管系統組織和細胞類型(表2)。2016年，兩組研究人員通過對胚胎心臟解剖定義區域的分析，獨立生成了所有主要心臟細胞類型在不同發育階段的單細胞圖。Li等人使用隨機森林算法分析了小鼠在胚胎期第8.5天(E8.5)至第10.5天的心臟轉錄譜，并能夠以91%的準確性預測個體心肌細胞在發育過程中的解剖位置，包括以胰島1標記的譜系追蹤細胞(Isl1;也被稱為胰島素基因增強蛋白(Isl1)，它存在于流出道和右心室64。del發笑等人采用了類似的方法，分析從E9.5至出生后第21天的心臟細胞，以揭示胚胎和出生后成熟過程中階段特異性心肌細胞的轉錄程序。這兩項研究都發現，同源框蛋白Nkx-2.5的缺陷導致心肌細胞成熟的嚴重缺陷，并描述了發育中的胚胎中已知的心肌細胞類型的大量異質性。
scRNA-seq也被證明對鑒定調節形成心臟的早期心臟譜系的出現和分離的機制非常有用。例如，小鼠野生型和Mesp1陰性的心血管祖細胞(CPCs)的單細胞轉錄組分析表明，Mesp1是祖細胞從多能性退出和早期胃腸期誘導心臟基因表達程序所必需的66。不同的Mesp1 CPC群體被發現對應于產生不同心臟譜系和解剖區域的祖細胞，并且在早期心臟發生過程中識別出與譜系承諾和多樣化相關的關鍵分子指紋，正如之前通過Cre loxp介導的譜系追蹤研究所顯示的那樣。在心臟命運決定的早期階段，Nkx2 5+/和Isl1+/+ CPCs的scRNA-seq也導致了之前未知的祖細胞亞群的鑒定。發育軌跡分析還表明，Nkx2-5的長時間表達使CPCs走向單向心肌細胞命運，而Isl1+/+ CPCs在分化成多個發育分支之前通過一個吸引狀態。同樣,從Nkx2-5和Isl1 lineage-tracing胚胎老鼠心臟細胞分離進行 scRNA-seq評估了第一和第二心臟區域的祖細胞分化識別了兩個祖細胞類型不同的分化動力學并揭示了CPCs和終末分化心血管細胞之間的溝通。同樣，對被囊動物心咽發育的scRNA-seq分析揭示了第一和第二心臟譜系中不同的分子信號通路。基于網絡的計算方法也被用于預測譜系特異性轉錄因子，Hand2被確定為流出道細胞而不是右心室細胞存在的標記物70。有趣的是，Hand2-null小鼠胚胎的右心室沒有正常形成，隨后的scRNA-seq分析表明流出道心肌規格的失敗，而不是右心室心肌規格的失敗，是先天性心臟缺陷表型的原因。這些發現表明，在單細胞水平上了解先天性心臟病的致病機制，對于準確定義和定位構成該疾病表型表現的細胞亞群至關重要。此外，單細胞測序的未來應用將有助于確定獨特的患者特異性病因，這些病因可能在病理生物學上有所不同，因為不同的細胞異質性和基因表達模式會導致共同的疾病表型。
成年心臟穩態與疾病
除了胚胎和出生后的心臟外，單細胞轉錄組學還被用于描述成年小鼠心臟的細胞亞群。通過對未受傷的成年小鼠心臟的非心肌細胞的scRNA-seq，在內皮細胞、心臟成纖維細胞和免疫細胞之間發現了一個廣泛的細胞間通信網絡，這可能參與維持心臟穩態61。此外，心肌細胞基因表達的類型特異性和性別特異性差異也可能參與心臟穩態和重構。出生后小鼠心臟的單核RNA測序發現了兒童線粒體心肌病小鼠模型的細胞類型特異性缺陷34。此外，使用SORT測序方法對穩態條件下和缺血損傷后的成人心臟進行分析，發現在已知細胞類型內存在多個亞群。成年小鼠心臟中的所有細胞，包括心肌細胞，使用FACS通過直徑為130 m的大噴嘴分離;使用高前向散射寬度可以豐富地分離出形狀不規則的成年心肌細胞，這一點通過tdTomato報告系譜追蹤方法得到證實。兩個獨立的組能夠通過無Langendorff酶解心室組織獲得存活的成年心肌細胞21,72，然而另一個研究小組報告，如果不使用Langendorff儀器，分離存活的和未破碎的心室心肌細胞很困難72。Gladka等證明缺血再灌注觸發在各種細胞類型中出現了以前未知的細胞亞群，并發現活化成纖維細胞中Ckap4的增加。使用Langendorff灌注和基于塊的方法73分別分離小鼠和人類心室，Nomura等人在Smart-seq2平臺上對成年心肌細胞進行scRNA-seq，在單細胞水平上識別肥厚心肌細胞的基因模塊。值得注意的是,Monocle-based cellular-trajectory分析小鼠心肌細胞在不同時間點的,經歷了TAC顯示p53 myocyte-specific增強劑的重要作用因素2核轉錄因子紅細胞兩個相關因子2信號軸促進DNA氧化損傷后心肌細胞肥厚亞群的致病基因的激活。這些發現被來自心力衰竭患者心肌細胞的scRNA-seq獲得的數據證實74。scRNA-seq 冰凍損傷斑馬魚心臟的心肌細胞邊界地帶顯示邊界地帶損傷后的心肌細胞單細胞轉錄組像胚胎心肌細胞,能夠解釋在斑馬魚心臟再生引起心肌細胞皮質骨小梁和皮質細胞類型過程中觀察到的小梁心肌細胞向皮層心肌細胞的轉變。
為了研究心肌梗死(MI)后新生血管中內皮細胞的異質性，Li等人對從內皮特異性譜系中分離出來的內皮細胞進行了基于液滴的scRNA-seq，在基線和MI后7天追蹤小鼠心臟。在PCA鑒定的10個內皮細胞群中，與對照組相比，心肌梗死后5個內皮細胞群顯著富集于心臟，同時與心臟重塑、內皮細胞細胞外基質相互作用、增殖和細胞周期調控相關的基因上調。質膜囊泡相關蛋白(Plvap)在MI后的小鼠心肌模型和人類心臟的5個集群中的3個高表達。有趣的是，Plvap表達的增加定位于梗死邊緣區的內皮細胞，一種與MI后促進內源性心臟組織修復的生長因子定位共享的分子模式。心肌梗死后7天對心臟成纖維細胞和免疫細胞的類似分析揭示了這些非心肌細胞群的動態通量，每一種細胞都有自己的中間過渡狀態和獨特的轉錄特征。
綜上所述，越來越多的研究已經使用scRNA-seq來闡明心肌梗死后各種非心肌細胞群的作用，提高了我們對缺血組織重塑過程中微環境變化的理解。未來的研究將受益于對這些細胞類型和過渡狀態的具體功能的更深入的機制研究，特別是在損傷后的不同階段，如早期急性炎癥(心肌梗死后1天)和晚期重塑(心肌梗死后30天)。這樣的研究將有助于更好地描述病理心肌纖維化過程中內皮細胞向間充質細胞轉變的動力學或間葉細胞到內皮細胞的過渡在心血管生成的期間。現在,轉錄組調查和后續的細胞間相互作用的驗證在non-cardiomyocyte細胞和心肌細胞之間的溝通在組織修復和重塑過程中還沒有被充分研究,并填補這些我們在知識方面的缺口有利于改善我們對不同階段參與心臟損傷和修復的細胞反應的理解。
scRNA-seq也被用于描述人類胚胎心肌細胞的基因表達狀況12。通過單細胞標記逆轉錄測序，從18個人類胚胎(妊娠5至25周)中提取了大約4000個解剖定義的心臟細胞，以繪制出人類心臟的發育軌跡。四種主要的心肌細胞類型(心肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和瓣膜間質細胞)被鑒定出來，心肌細胞和成纖維細胞在發育過程中都經歷了基因表達的逐步變化12。重要的是，人類和小鼠心臟之間的比較分析揭示了人類心臟發育的幾個獨特特征，表明存在種間差異，這些差異可能在bulk分析中不明顯，但可能在單細胞轉錄組水平上可以辨別出來。Cui等人比較了小鼠和人類scRNA-seq數據集中發育中的心臟中的四種主要細胞類型(心肌細胞、內皮細胞、成纖維細胞和心外膜細胞)，并報告稱，在研究的細胞類型中，來自人類和小鼠的心肌細胞在轉錄上最相似12。進一步的轉錄組分析顯示,心肌細胞在小鼠和人類7周E10.5最為相似,而5-week-old從人類最類似成纖維細胞在小鼠E9.5,指示異步小鼠與人類之間的時間軸在心臟細胞的分化和成熟發展。此外，RNASE1在人內皮細胞中特異性表達，在人成纖維細胞中特異性表達THY1，在人心外膜細胞中特異性表達CFB和ITLN1，所有這些都在小鼠心臟中低水平表達。相比之下，Icam2在小鼠內皮細胞中特異性表達，Rnf213在小鼠心外膜細胞中特異性表達，突出了不同細胞類型基因表達譜的種間相似性和差異。目前正在努力生成大規模的、單個的人類成年心臟圖譜，特別是使用心肌細胞的單核RNA-seq和非心肌細胞的scRNA-seq?82。總之，這些研究證明了scRNA-seq在深入了解細胞間變異和確定心臟發育和疾病中的關鍵轉錄程序方面的效用。
血管和造血細胞
冠狀血管的形成是一個高度動態、有序的發育過程。盡管動脈和靜脈的發育受相互拮抗的轉錄程序控制，但在發育和再生過程中，預先存在的靜脈往往通過未知的細胞命運轉換產生新動脈。scRNA-seq技術在闡明血管發育過程中細胞的動態轉變方面發揮了關鍵作用。例如，將scRNA-seq與譜系追蹤轉基因小鼠結合發現，冠狀動脈是由發育過程中由靜脈細胞衍生的特定前動脈群體形成的57。研究發現，靜脈細胞逐漸從靜脈表型轉變為動脈表型，直到細胞亞群克服轉錄閾值轉變為動脈前狀態。靜脈特異性轉錄因子政變轉錄因子2 (COUP- tf2)被認為是這一命運開關的關鍵中介，為靜脈源性動脈形成的機制提供了分子視角。健康成年小鼠的主動脈單細胞圖譜識別了所有的主動脈細胞類型及其亞群85，幼齡(8周)和老年(18個月)小鼠的主動脈對比顯示內皮細胞群的轉錄組差異很大。
scRNA-seq也被用于描述主要血管疾病中的細胞狀態和命運決定。動脈粥樣硬化動脈是由多種細胞組成的，包括內皮細胞、血管平滑肌細胞和免疫細胞，這些細胞對細胞外細胞的可塑性和敏感性各不相同。特別是，盡管VSMCs是一種終末分化的細胞類型，但眾所周知其可塑性很強，使用單細胞分析有助于描繪VSMCs的細胞表型調節為一種獨特的成纖維細胞樣細胞類型(稱為纖維細胞)91。此外，單細胞分析有助于識別指導人類動脈粥樣硬化血管中VSMC分化狀態的特定組蛋白變體92。動脈粥樣硬化的典型特征是大量的免疫細胞，包括一些巨噬細胞亞群，它們的功能和表型特征較差，部分原因是標記物數量有限。為此，應用涉及健康和動脈粥樣硬化主動脈巨噬細胞的scRNA-seq數據的非監督聚類分析，可以與健康對照組相比，識別富集于病變主動脈的髓系亞群93。這些亞群包括單核細胞、單核細胞來源的樹突狀細胞和兩個巨噬細胞群，這些巨噬細胞富含炎癥分子，激活髓系細胞2 (TREM2)和IL-1β表達的觸發受體，幾乎只在動脈粥樣硬化主動脈中可見。類似地，單細胞分析方法與大規模細胞測定術(CyTOF)結合使用，在小鼠動脈粥樣硬化斑塊中生成更廣泛的免疫細胞庫圖譜94?？偟膩碚f，在病變的主動脈中發現了11種不同的白細胞群，包括三個主要的B細胞亞群，以及在主動脈白細胞中富集的幾種細胞類型特異性通路。重要的是，主動脈白細胞的組成可以預測動脈粥樣硬化患者的臨床事件，這表明單細胞分析具有翻譯潛力。對6 - 8周齡小鼠降主動脈內皮細胞的scRNA-seq顯示了三種主要的細胞群:成熟血管內皮細胞、有間充質特征的內皮細胞和有炎癥特征的內皮細胞。
器官圖譜
除了對特定組織或器官系統進行鑒定外，單細胞轉錄組分析也在更大范圍內進行，以建立各種主要器官的全面細胞圖譜6,7。使用組合索引法，在妊娠第9.5天13.5天，從61只小鼠胚胎中的200萬個細胞中生成了小鼠器官發生細胞圖譜，允許可視化所有類型細胞的發育軌跡96。一份名為Tabula Muris的單細胞轉錄組數據匯編，涉及來自20個不同成年小鼠器官和組織的10萬個細胞，也使用基于流式細胞儀和基于液滴的scRNA-seq方法生成6。該數據集對于確定細胞類型的基因表達差異特別有用，這些細胞類型存在于許多組織中，如內皮細胞、心臟成纖維細胞和組織常駐免疫細胞(如巨噬細胞)。基因表達指紋和獨特的表面標記蛋白的鑒定可以提高這些細胞的分離和鑒定，為新的靶向治療打開大門。該Tabula Muris概要是公開可用的，允許所有領域的研究人員不僅使用它作為一個生物學參考，而且進一步貢獻其更詳細的分析?；诮M合索引(sci-ATAC-seq)構建了一個類似的單細胞染色質可及性圖譜，以評估13個不同的成年小鼠組織。sci-ATAC-seq數據與前面提到的scRNA-seq圖譜的配對揭示了大多數重疊器官的細胞類型分配的顯著一致性，盡管有些在肺和大腦中發現了差異。但這些綜合方法為闡明不同組織和細胞類型的表觀遺傳和轉錄調控的復雜機制提供了廣闊的前景。多機構聯盟已經形成,目前正產生人類細胞地圖冊,包括人類細胞Atlas consortium97陳扎克伯格倡議和人類生物分子圖譜計劃(HuBMAP) 98年由美國國立衛生研究院,這將使變化的表征,在成人心臟內的所有細胞類型在自然老化和應對疾病(圖4)。最后,公開訪問的數據庫scRNA-seq研究,如PanglaoDB99、scRNASeqDB和SingleCell Portal可以在線獲得，其中scRNA-seq數據集可以根據原始組織或細胞類型進行分類和識別，包括人類和小鼠的心臟、血管和iPSC衍生物。
多能干細胞模型
人類iPSC模型已被證明在患者特異性疾病建模和再生治療中有用，但主要的挑戰，包括iPSC來源的心血管細胞的不成熟和未解決的異質性，仍然存在。因此,許多研究利用scRNA-seq確定了參與分化的轉錄調節信號通路,識別引起的所有細胞分化類型,和優化和修改方案去生成專門的心臟和血管細胞亞型(表3)。
利用現有方法生成的人類ipsc衍生心肌細胞(iPSC-CMs)在形態、大小、電生理特性、鈣處理、收縮性和代謝功能方面具有胎兒般的特征。Friedman等人對處于iPSC-CM分化不同階段的40000個細胞進行了scRNA-seq，并報道了非dna結合同源結構域蛋白HOPX的失調導致iPSC-CMs的持續不成熟狀態。在另一項研究中，從多余10,000個細胞基于液滴的scRNA-seq中鑒定出iPSC-CM分化過程中的心臟轉錄調控因子;iPSC-CMs表達COUP-TF2和T-box轉錄因子TBX5更為成熟和心房樣形象,而與YRPW毛/ enhancer-of-split相關主題的表達蛋白2 (HEY2) iroquois-class homeodomain蛋白質IRX4和肌球蛋白輕鏈2,心室/心肌同種型(MYL2)富含心室樣 iPSC-CMs。通過對等基因iPSC系的基因組編輯，證實轉錄因子NR2F2和HEY2分別在形成類心房、類心室的iPSC- cms電生理和基因表達譜中發揮著不同的調控作用?？傊?，這些研究的結果強調了iPSC-CMs的異質性，并揭示了控制細胞成熟和特異腔室人iPSC-CMs的特點的心臟轉錄因子。
人ipsc來源的內皮細胞(iPSC-ECs)也已被用于血管疾病建模，并在體外有效地概述遺傳和環境因素對血管功能障礙的影響。然而，與iPSC-CMs一樣，目前可用的iPSC-ECs受到細胞不成熟和異質性的限制。誘導分化過程中基于液滴的iPSC-ECs的scRNA-seq導致iPSC-ECs的四個主要亞群被富集的基因表達APLNR、CLDN5、ESM1和GJA5標記;CLDN5+簇代表代謝活躍的iPSC-ECs, GJA5+簇代表動脈樣iPSC-ECs, APLNR+簇代表炎癥反應性iPSC-ECs, ESM1+亞群代表活化細胞。在另一項研究中，McCracken等人對兩獨立的人類胚胎干細胞來源的內皮細胞(ESC-EC)分化方案進行了縱向基于液滴的scRNA-seq分析。ESC-EC產品方案擬時間軌跡顯示分化為內皮細胞和間充質細胞類型在第6天分化,與接受成熟細胞類型分化在第八天,以減少表達間充質細胞的SNAI2和增加表達ANGPT2為特點,ESM1和GNG11在內皮細胞群。盡管在最初的內皮細胞承諾后，ESC-ECs進一步成熟，但沒有進一步的器官特異性內皮表型承諾的標志物被觀察到。未來的研究應側重于識別器官特異性轉錄組學特征，并進一步優化分化方案去產生解剖定義的多能干細胞來源的ECs。
單細胞多組學方法
組合索引
目前，scRNA-seq技術的一個主要局限性是從分離的單細胞中制備RNA-seq文庫的成本很高。成本隨細胞加工數量的增加而線性增加，這給單個實驗室和多機構聯盟造成了巨大的障礙。為了應對這一挑戰，新的多路復用方法被開發出來，以增加通量，同時也降低每個單元的成本。其中一種方法是組合索引，這涉及到使用兩種獨立但概念相同的方法，即單細胞組合索引RNA測序108和基于連接的分裂池轉錄組測序109，在這種方法中，單個細胞或細胞核被分離、貼條形碼、合并，然后再次分裂以獲得額外的條形碼。與基于液滴或微孔平臺使用的單個條形碼不同，多輪細胞分裂和條形碼索引能夠對大量單細胞或細胞核的轉錄組進行獨特的標記。這些組合索引策略可以將分析的細胞數量增加10倍到1000倍，而不需要對單個細胞進行物理隔離。這項技術的最新迭代可以在一次運行中從60個胚胎中提取多達200萬個細胞。然而，盡管在通量上有令人矚目的增長，組合索引通常產生較淺的測序深度，可能無法識別極其罕見的細胞群，這通常是執行scRNA-seq分析的主要目標（通量-測序深度--識別細胞群上的區別）。因此，這是一種取舍在優化實驗設計和設置時，應仔細考慮實驗的廣度和深度。
組合單細胞技術
除了scRNA-seq技術，還有無數其他單細胞組學技術也在開發或使用中。這些技術包括單細胞染色質可及性(如scATAC-seq)、DNA甲基組學和蛋白質組學，所有這些技術都攜帶著獨特的信息，這些信息不能僅由scRNA-seq完全捕獲，即使在其最大深度和通量。例如，染色質組織和可及性的整體或局部變化可以先于主要的轉錄事件，在mRNA表達水平上檢測到它們之前，并可能代表一個更穩定的細胞表型或狀態。scATAC-seq已被開發用于同時探測數以萬計細胞的染色質可及性譜，并識別控制轉錄的調控元件。這項技術已經開始揭示果蠅胚胎發生(人類造血)以及T細胞受體特異性的新調控環境。scATAC-seq需要考慮的一點是，它通常需要額外的步驟來物理隔離單個核，考慮到在多次離心和再懸浮過程中核膜的脆弱性和半通透性，這一過程需要額外的小心。與scRNA-seq一樣，根據感興趣的樣本定制隔離方案對于確保核的完整性和敏感性至關重要。隨著這些工作流程的持續優化，預計scATAC-seq將改變我們探究表觀基因組調控機制的方式，特別是在分析平行scRNA-seq基因表達譜時。一項較早的研究表明，兩種組學平臺可以通過一種新的基于索引的聯合分析在算法上或同時集成。
與染色質可及性一樣，dna甲基化景觀也可以為不同細胞的分化潛能和轉錄活性提供獨特的見解，這些方式可能無法通過RNA表達反映或推斷出來。各種各樣的策略已被開發用于單細胞DNA甲基組分析，其中一些已經與scRNA-seq或染色質可及性數據配對，以揭示表觀遺傳和轉錄調控的協調機制。然而，盡管在整合多組學數據方面取得了進展，但我們對這些調控過程如何自身分層表現為下游細胞表型和行為狀態的理解仍然有限。一個技術瓶頸似乎是缺乏一種類似的單細胞方法，可以以類似的靈敏度和通量來詢問細胞蛋白質組。綜合方法允許同時審訊單細胞轉錄組連同成千的蛋白質已經開發使用oligonucleotide-conjugated抗體,稱為細胞轉錄組的索引和抗原表位進行排序(CITE-seq)或TotalSeq,但這些方法目前限于少數表面蛋白和依賴的可用性專門設計的抗體。單細胞蛋白質組學這一新興領域正在不斷努力，以開發可替代的蛋白質檢測方法，以提高靈敏度和范圍(如Edman降解的變化)，改進樣品制備管道和改進基于質譜的平臺。工作流程的優化和標準化可能對實現真正的單細胞分辨率的整體多組學分析至關重要，該分析可以在蛋白質水平上連接上游基因調控機制和觀察到的下游表型。
最后,空間轉錄組正迅速成為一個強大的技術,提供了一個全新的維度在單細胞附近解決上述組學技術(圖2)。例如,條形碼oligo-dT微陣列幻燈片已經成功地用于RNA映射到特定XY-positions在組織切片上解決~ 100μm分辨率 (ref。128)。一種被稱為玻片測序的新方法是將組織樣本中的RNA轉移到覆蓋著已知位置的dna條形碼珠子的表面，這樣就可以通過測序來確定RNA的空間位置。該方法大大提高了轉錄組圖譜的空間分辨率至10 m，與細胞的平均長度大致匹配，為組織的高維結構分析和復雜的類器官模型提供了廣闊的前景。Asp等人通過整合空間轉錄組學、scRNA-seq和原位測序，生成了人類心臟在前三個月發育的時空圖譜，以創建3D空間細胞圖譜。其他組學技術的類似方法(如染色質可及性的空間映射)也有望在不久的將來出現，為使用定位坐標可追蹤到單細胞的高維多組學分析打開大門。心血管精準醫學
衛生保健的主要挑戰之一是患者對治療的反應并不一致。目前，市場上大約90%的藥物對50%的治療無效。這些病人特異性藥物反應的機制仍然是難以捉摸的，與廣泛的遺傳和環境因素似乎有貢獻。在這些因素中，患者特異性細胞間的異質性被認為是個體間藥物反應差異的基本因素和驅動因素，這凸顯了單細胞技術在推進精準醫療中的日益重要的作用。
scRNA-seq的早期臨床應用主要集中在腫瘤。原發性腎腫瘤及其肺轉移顯示出相當大的細胞異質性，針對兩個獨立通路的聯合治療已被證明比單一治療更有效132。與此同時，其他研究表明，多種非惡性腫瘤相關細胞，包括基質細胞和免疫細胞，在腫瘤進展和維持中發揮關鍵作用。毫不奇怪，給定腫瘤組織的細胞組成因患者不同而有很大差異，這對診斷和治療反應有重要意義。同樣，心血管疾病的治療也是次優的，因為患者在藥物反應方面存在顯著差異135。例如，來自不同個體的iPSC-CMs的Bulk轉錄組分析揭示了人與人之間對常見心血管藥物的細胞和分子反應的差異136,137。然而，這些Bulk分析無法檢測可能導致不同藥物反應的細胞異質性的個體特異性差異，單細胞多組學分析將是揭示這些信息的關鍵。
由scRNA-seq生成的細胞圖集顯示，心臟和周圍血管系統由多種細胞類型組成，包括心肌細胞、成纖維細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞、瓣膜間質細胞和居民免疫細胞，每一種細胞類型都可以進一步分為亞型。不同類型的細胞，特別是非心肌細胞對心臟發育、內穩態和疾病的功能貢獻越來越受到重視，這促使近年來對各種心血管疾病中新的細胞群和亞型的單細胞研究迅速增加。然而，與癌癥一樣，心血管細胞群的組成和行為在個體之間有很大差異，這可能導致治療反應的不一致。
未來應對這些挑戰的一種方法是在臨床干預之前創建患者特異性細胞圖譜。可以想象，基于scrna序列的細胞數量、基因表達譜和細胞異質性的評估將補充現有的診斷測試，并幫助醫生確定最有效的、個性化的治療方案。以往使用scRNA-seq發現的患者血漿生物標志物的分析，或者在一些罕見病例中，通過活組織檢查或間隔肌瘤切除術獲得的患者心臟樣本的直接分析，原則上可用于監測疾病狀態和選擇最佳治療時間點。在某些情況下，異常高數量的免疫細胞或升高的細胞因子表達可能鼓勵聯合治療免疫調節藥物，以限制干預后延長炎癥。考慮到它的高靈敏度，scRNA-seq也可能在臨床中檢測疾病狀態下稀有細胞群體被證明是有用的，那可以更有效地靶向和輸送藥物。
盡管有這些潛在的好處，在scRNA-seq可以常規應用于臨床之前，必須克服許多技術、后勤和資金障礙?？紤]到其固有的復雜性，scRNA-seq作為一種獨立的治療決策技術可能是不可行的，而且它將來整合到臨床環境中很可能需要進一步發展組合分析和并行診斷試驗。此外，實施將需要樣品制備和數據分析的標準化協議，以及醫生友好的界面和軟件。其他重大的財政和后勤考慮可能會阻礙將該技術立即納入目前的保健系統。然而，考慮到scRNA-seq技術在最初幾次迭代中獲得的勢頭，這些挑戰很可能得到解決。隨著scRNA-seq管道的持續改進、測序成本的降低以及數據驅動的精準醫學的進步，轉譯單細胞應用將繼續增長，并很可能重新定義未來患者的治療方式。
結論
在過去的幾年里，轉錄組學已經實現了一個巨大的飛躍，從對個體平均群體的研究發展到對單個細胞的分析。盡管它的歷史很短，但scRNA-seq已經開始推動跨學科的新發現，這是傳統的Bulk分析方法不可能實現的。僅在心血管領域，scRNA-seq已被許多群體使用，并在識別新細胞群、闡明譜系軌跡和表征各種發育和疾病背景下的細胞間通信方面發揮了作用。除了使用在細胞解體特定類型的變化發展和疾病,scRNA-seq技術也被用于生成心血管等各種組織的單細胞圖譜(表2)。這些圖譜形成了可以公開訪問的參考數據庫,這可供來自各個領域的研究人員進一步分析。
盡管仍存在一些技術限制，但隨著實驗和分析管道的不斷改進和標準化，預計scRNA-seq在基礎研究和轉化研究中的應用將呈指數增長。特別是，將scRNA-seq與其他組學技術(如單細胞基因組學和scATAC-seq)相結合，目前正在進行研究，有望闡明單細胞分辨率的基因調控機制。將多組學方法整合到當前的工作流程中存在許多挑戰，但也有望與實驗室和臨床的現有方法相結合。因此，scRNA-seq技術不僅有潛力改造基礎科學，而且有潛力推進精準醫學。
