Review of Single-Cell RNA Sequencing in the Heart
導讀：單細胞RNA測序(scRNA-seq)技術是一種強大的，快速發展的工具，用于表征單個細胞和闡明細胞水平的生物學機制。心血管疾病是世界范圍內的主要死亡原因之一，其確切的病理機制尚不清楚。scRNA-seq為健康和病態心臟提供了許多新的見解。在這篇綜述中，研究人員總結了各種scRNA-seq平臺，并描述了通過scRNA-seq分析揭示的心血管發展和疾病的分子機制。接著，研究人員描述了scRNA-seq的最新技術進展。最后討論了如何利用scRNA-seq技術將基礎研究轉化為臨床醫學。
論文ID
原名：Review of Single-Cell RNA Sequencing in the Heart
譯名：單細胞RNA測序在心臟中的綜述
期刊：Int. J. Mol. Sci
IF：4.556
發表時間：20201106
通訊研究人員：Seitaro Nomura
通訊研究人員單位：東京大學醫學院心血管醫學系
DOI號：10.3390/ijms21218345
實驗設計
介紹
下圖總結了本文的內容。作者首先介紹適用于每種細胞類型的scRNA-seq平臺。接下來，作者描述了scRNA-seq分析揭示的心血管發展和疾病的分子機制。然后，作者介紹了scRNA-seq的最新技術進展。最后，作者討論了如何利用scRNA-seq將基礎研究轉化為臨床醫學
結果
2.1針對小細胞的平臺
IFC（整合液體循環）
分選細胞進入腔室in a more automated manner. Cells are automatically lysed, and cDNA libraries are quickly prepared for sequencing. IFC captures cells less than?25 μm in diameter and processes up to?800 cells.?FACS and IFC are?platebased platforms,?and thus the number of cells that can be sorted and analyzed is limit
Both Drop-seq [5] and Chromium (10× Genomics), which is a commercial droplet-based platform allow for the rapid profiling of thousands of individual cells by encapsulating them in tiny droplets, adding barcodes to each cell’s RNAs, and sequencing?them together. a microflfluidics device to perform droplet separation; therefore, the size of cells that can be analyzed is generally?less than 30 μm in diameter.（所以成年心肌細胞用小細胞平臺沒法分離） ?
評判單細胞轉錄組測序的一種方法以及平臺的選擇需要考慮：檢測基因的能力檢測細胞數量的能力??
液滴基于的系統（500-1500基因，多細胞） ?板基于的系統（1000-4000基因，少細胞），板和液滴均適合于小和正常的細胞
2.2針對大細胞
有人嘗試FACS with a larger nozzle size (130μm) to perform scRNA-seq of adult murine CMs 。. ICELL8（擁有成像系統，能可視化納米孔，可以看出納米孔中是單細胞還是多細胞；死細胞還是活細胞）
Manual pick-up and mouth pipettes （配合顯微鏡用，挑出來，以最佳的形態進行測序---這就要求技術人員很熟練與這樣通量可能就會比較低）
由于檢測成年心肌細胞的平臺少，并且具有的基于板的檢測平臺通量也低，所以目前針對于成年心肌細胞多用核檢測。
3. scRNA-seq and Cardiovascular Development and Disease
3.1鼠胚胎與新生小鼠心臟（相較于成年心臟，新生CM的優點：細胞外基質柔軟；小；體外活力強）
scRNA-seq of CMs from murine embryonic or neonatal hearts have been performed using IFC, FACS, and a mouth pipette or droplet systems.
scRNA-seq has revealed some key factors in CM maturation。兩個團隊運用IFC系統獲得了數千個...，他們揭示了與表明Nkx2.5。Xiong等利用FACS發現Nkx2-5直接調控第二心場趨化因子受體Cxcr2和Cxcr4的空間表達，以時空精度引導第二心場心臟祖細胞遷移。除了Nkx2-5，Mesp1 is also essential for CM maturation. 胚胎心臟祖細胞的scRNA-seq顯示Mesp1是退出多能狀態和誘導心血管基因表達程序所必需的
scRNA-seq還揭示了心臟發育并不只發生在心肌細胞內。后面介紹利用什么平臺，測序什么發生上皮細胞與間充質細胞也能發生作用。（關鍵影響因子在心臟形成中的作用），低通量描述了一些機制。高通量探索也發現一些影響心臟發育的相關因子。-Hand2；病理與生理狀況下心臟發育的分析。Gdf15的轉錄組激活
最近，心臟特定的區域也被單細胞轉錄組測序研究了。誰誰誰運用了什么平臺探究了哪個階段小鼠的區域。因此，在心臟發育過程中，每個區域的獨特表達基因和表達變化被鑒定出來。
總結，發現了影響心肌細胞成熟的因子與心臟發育過程中，CM本身的變化。最后闡述了單細胞轉錄組測序的作用。scRNA-seq analysis research addressing these complex questions are expected.
3.2成年鼠心臟
新生胚胎心臟用于研究心臟發育和分化，成年心臟用于研究鼠疾病模型的病理形成。(MI)(I/R) (TAC)。成年CMs易受沖擊，對pH和鈣離子濃度敏感，長軸直徑較大(>100 m);因此，與胚胎或新生兒CMs相比，它們更難分離和分選。一些平臺已得到改進，允許成年CM的scRNA-seq，并揭示了疾病模型中的一些關鍵機制和反應。scRNA seq發現損傷時成纖維細胞激活，CM無增殖。這些發現表明可通過控制成纖維細胞激活來預防心肌梗死后過度纖維化的可能性以及加速CM增殖的難度。
TAC：壓力過大 心功能 心衰機制 什么導致了CM異質性信號，可能是intrinsic (e.g., p53) and extrinsic signals
區域特定性Marker
細胞核測序的優點：1.去線粒體基因；2.小可以運用多種單細胞轉錄組平臺檢測 （單核RNA seq與單細胞RNA seq比較的文章看一下 3.細胞類型分辨率 4.轉錄組靈敏度
4.scRNA-seq and Applications
4.1 細胞與細胞互作 配體受體網絡 CellPhoneDB
4.2 空間轉錄組 熒光測序原位雜交 （基于mRNA原位雜交技術）
成像細胞術去分析281例乳腺癌患者171,288個細胞中35個蛋白的定位
心臟空間基因表達（Some studies have investigated spatial gene expression in the heart. For example, Satoh et al. spatially quantifified gene expression at the single-cell level in the heart after TAC and found spatially heterogenous Myh7 expression in CMs after TAC。（學一下，人家段落展開的表達）心梗后不同區域影響心梗修復。因此，了解每個區域的轉錄組變化將導致新的治療目標的MI。
4.3軌跡分析 時間評估也是單細胞分析的另一個重要因素。在發育或疾病進展過程中，基因表達的時間變化是必不可少的。分析時序性基因表達變化的方法主要有兩種:基于scRNA-seq的細胞軌跡預測(稱為軌跡推斷);利用DNA條形碼的譜系和整合每個細胞的轉錄組(譜系追蹤)。
Trajectory inference?interprets a single cell as a snapshot of a continuous process and reconstructs the pseudotime by analyzing transcriptional changes between neighboring cells
軌跡推斷將單個細胞解釋為連續過程的快照，并通過分析相鄰細胞之間的轉錄變化重建偽時間。。軌跡推斷方法：, such as Monocle [52], Wanderlust [53], Slingshot [54], and PAGA [55], have been developed.這些方法的不同之處在于模型路徑的復雜性，它們是簡單的線性軌跡、分岔軌跡或多分岔軌跡。Velocyto是一個軟件包，通過區分未剪接和剪接的mrna，從估計RNA速度分析表達動力學。
譜系追蹤：插入barcode到分裂之前的目細胞基因組DNA。目前心臟領域無用此方法，使用scRNA-seq分析的譜系追蹤有可能揭示心臟細胞轉變的精確機制
軌跡推斷：（目前在心臟研究中主要用軌跡推斷）
[if !supportLists]5.?[endif]展望
作者先陳述了單細胞轉錄組在疾病與健康心臟中提供的新見解以及在疾病形成和心臟發育過程中的作用。接著描述了目前單細胞轉錄組以高時間和空間準確度的分子水平的研究，而非單純的細胞水平的研究。（總說)
另外，臨床數據與scRNA測序的結合在其他疾病中的研究流行。作者先介紹了兩例結合單細胞與臨床測序數據在其他領域的研究及發現。接著描述了一例在患有心肌病的心肌細胞中研究以及發現。
與其他器官一樣，將scRNA-seq與心臟的臨床數據聯系起來有可能帶來新的見解和治療方法。要實現這一目標，必須將基礎研究轉化為臨床醫學。（總說）
