人類心臟形態形成的過程尚不完全清楚。它的全部特性需要用單細胞空間分辨率在器官范圍內對基因表達進行深入探索。在這里，我們提出了一種分子方法，揭示了胚胎心臟在三個發育階段的細胞類型的全面轉錄景觀，并將細胞類型特異性基因表達映射到特定的解剖結構域?？臻g轉錄組學鑒定了在每個發育階段對應不同解剖區域的獨特基因圖譜。通過單細胞RNA測序鑒定的人胚胎心臟細胞類型，證實并豐富了胚胎心臟基因表達的空間注釋。然后使用原位測序來細化這些結果，并創建三個發育階段的空間亞細胞圖譜。最后，我們制作了一個人類心臟發育的公共網絡資源，以促進未來對人類心臟發生的研究。

• 在人類心臟發生中的時空基因表達模式
• 在人類胚胎心臟中繪制細胞類型分布和空間組織
• 深入分析了不同細胞類型在心臟發育中的作用
• 人類胚胎心臟的公共可用網絡資源

(A)本研究包括的三個人類心臟組織的發育階段。天數被定義為受孕后的天數。(B)本研究中提出的分子方法概述;其步驟如下:(1)利用ST技術探索三顆心臟的轉錄全時空模式;(2)利用scRNA-seq技術在中間時間點解剖心臟細胞類型異質性;(3)利用ISS技術以亞細胞分辨率定位關鍵基因;(4)生成三維基因表達圖譜。

(A C)對4.5 5 PCW (A)、6.5 PCW (B)和9 PCW (C)心臟樣本的組織切片進行免疫染色，顯示其整體解剖結構。肌鈣蛋白T (TNNT2)的空間蛋白表達在左右心室及左右心房均有發現。OFT顯示主動脈平滑肌肌動蛋白(ACTA2)的空間表達，顯示主動脈和肺動脈在三個階段的逐漸形成(以白色虛線表示)。在6.5 PCW和9 PCW時(由白色箭頭表示)位于心外膜下間質的冠狀動脈中也可以看到ACTA2。含肺靜脈的縱隔組織(ACTA2)只在晚期可見(以橙色虛線表示)。(D)從4.5 5、6.5和9 PCW人類胚胎心臟的19個組織切片中減少和聚類3115個點。每個簇注釋的解剖區域如下所示。(E G)將所有10個聚類的數據點映射到它們的空間位置表明，聚類集中在不同的組織學區域。放大的組織結構圖像顯示在F1 F3中。(H)差異基因表達分析顯示所有10個聚類中出現和下調的基因。調整后的p值<紅色表示0.01，黑色表示調整后的p值r0.01。(A C)和(E G)圖形包含平鋪圖像覆蓋整個組織。

(A)散點圖顯示6.5 PCWheart樣本細胞聚集基因計數與6.5 PCW心臟樣本斑點聚集基因計數之間的皮爾遜相關性。(B)聚類染色的6.5 7 PCW心臟的3717個單細胞的維數減少和聚類。被識別的細胞類型，是注釋的基礎上的標記基因信息，顯示在右邊。(C) tSNE圖如(B)所示，根據細胞分離前得到的各自心臟部分的來源，對細胞進行染色。虛線的部分(我)說明了集群1(心室心肌細胞),這是目前在相當大的程度上在分數(ii)。虛線部分(2)說明缺席集群5,7和14(平滑肌細胞/呈、心房心肌細胞和心臟神經嵴和施旺祖細胞),它們存在于分數(i)。

(A) smFISH分析的6.5 PCW心臟樣本的組織切片，顯示MYH7、TBX18和OGN基因的空間分布。比例條:(A) 1000 mm， (A1) 10 mm， (A1a) 5 mm， (A2) 10 mm， (A2a-b) 5 mm。(B) ISS分析的6.5 PCW心臟樣本的組織切片，顯示匹配的基因表達模式。MYH7定位于心室，TBX18定位于心外膜，OGN定位于OFT區域。比例條:(B) 1000mm， (B1) 50mm， (B1 - B) 10mm， (B2) 50mm。(A和B)圖形包含平鋪圖像，覆蓋整個組織。

(A) ISS鑒定的69個基因轉錄在6.5 PCWheart組織切片中的分布?；蛐盘栆苑柕男问斤@示，顏色按其所屬簇進行分組，如圖3B所示。只包括分配給細胞的讀取以作進一步分析。(B) (A)中所示的基因轉錄的概率細胞圖。該圖顯示了20,920個細胞，以匹配scRNA-seq簇的概率餅狀圖表示。每個餅圖的比例用顏色編碼，如圖3B所示。(C)將(A)中所選區域的放大圖像。識別出的基因信號根據其聚類身份以彩色符號表示。(D)放大(B)對應區域的圖像。每個餅圖代表一個單元格，其大小與分配給該單元格的讀取次數(最小5次)成比例。(E)讀數的分布和分配，以及細胞簇在單細胞水平上的概率分布。(C)和(D)中的示例展示了讀取如何分配給單元以及單元如何分配給集群。頂部面板:分配和分配讀到四個示例單元格。白線將讀取連接到分配給它們的單元格。DAPI染色的細胞核呈灰色。底部面板:餅狀圖，顯示上述四個示例單元格如何與每個集群匹配。顏色是細胞類型特有的。(A)圖包含平鋪圖像，覆蓋整個組織。

(A和B)的比較基因表達檢測在圣scRNA-seq,和空間站特定標記基因許旺祖和心臟神經嵴細胞(A)和心外膜細胞和EPDCs (B)。每一個標記基因表達了在圣組織部分的熱圖和scRNA-seq tSNE情節,作為小提琴情節整個scRNA-seq集群和注冊記錄在國際空間站的組織部分,分別。(C)概述分別為4.5 5、6.5和9 PCW的心臟組織切片。(D)三個時間點的OFT域放大圖像，顯示ISS檢測到的ISL1和ALDH1A1亞細胞基因表達。在顯示MYBPC3、TBX18、ITLN1、ISL1和ALDH1A1亞細胞基因表達的三個時間點上，放大右(E)和左(F) AV心外膜下間質結構域的圖像，大小為200mm (E和F)。(G)基于細胞概率作圖的心外膜細胞(第9簇)和epdc細胞(第3簇)的空間分布。每個數據點(即單元格)用餅圖表示，顏色編碼如圖3B所示。(A F)數字包含平鋪圖像覆蓋整個組織。

(A) 6.5 PCW人類胚胎心臟三維基因表達參考模型的數字化構建。該模型在這里說明了從前部、側面和頂部觀察的9個ST組織切片中ST斑點的位置。在圖2F中，ST點是由它們的集群標識著色的。(B)與(A)中所見的相同的3D數字結構，但這里展示了ISS的概率細胞圖。該圖像顯示了來自6.5 PCW組織切片的20920個細胞，按細胞類型標識著色，如圖3B所示。