In-depth proteomic analysis reveals unique subtype-specific signatures in human small-cell lung cancer
深入的蛋白質(zhì)組學(xué)分析揭示了人類小細(xì)胞肺癌中獨(dú)特的亞型特異性特征
發(fā)表期刊：Clin Transl Med
發(fā)表日期：2022 Sep
影響因子：8.554
DOI:? 10.1002/ctm2.1060
一、研究背景
小細(xì)胞肺癌（SCLC）約占所有肺癌的13%-15%，它仍然是最致命的惡性疾病形式之一。它有一個(gè)非常積極的過程，其特點(diǎn)是廣泛的染色體重排，高突變負(fù)擔(dān)和幾乎普遍的腫瘤抑制基因TP53和RB1的失活。盡管SCLC以前被認(rèn)為是一種具有單一形態(tài)類型的同質(zhì)性疾病，但最近SCLC研究的進(jìn)展導(dǎo)致了主要基于神經(jīng)內(nèi)分泌（NE）特征和獨(dú)特分子譜的亞型特定分類的發(fā)展。因此，SCLC可根據(jù)關(guān)鍵NE標(biāo)志物（即SYP、CHGA、NCAM1/CD56和GRP）的表達(dá)模式分為NE高和NE低亞型。
基于質(zhì)譜（MS）的蛋白質(zhì)組學(xué)能夠大規(guī)模分析復(fù)雜的生物系統(tǒng)，如細(xì)胞、組織或血漿。利用現(xiàn)代高分辨率質(zhì)譜儀和先進(jìn)的樣品制備工作流程，平行檢測和定量數(shù)以千計(jì)的蛋白質(zhì)，包括那些豐度較低的蛋白質(zhì)，能夠更好地了解癌癥中的分子相互作用和信號通路。
二、材料與方法
1、數(shù)據(jù)來源
1） 數(shù)據(jù)庫：三個(gè)分泌組數(shù)據(jù)庫，人類蛋白質(zhì)圖譜、SPRomeDB、MetazSecKB；人類蛋白質(zhì)圖譜的信息被用來注釋人類血漿中可通過免疫測定、質(zhì)譜或接近延伸試驗(yàn)檢測的蛋白質(zhì)；使用兩個(gè)數(shù)據(jù)庫來檢索細(xì)胞表面蛋白的清單，即The Cancer Surfaceome Atlas 和Bausch-Fluck等人的in silico human surfaceome；為了注釋具有亞型特征的"可藥用"蛋白質(zhì)，使用了人類蛋白質(zhì)圖譜網(wǎng)站上的可藥用蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫
2） SCLC組織樣本的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：38個(gè)SCLC-A，5個(gè)SCLC-N，7個(gè)SCLC-P和2個(gè)SCLC-Y樣品
3） SCLC細(xì)胞系的基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)：癌癥細(xì)胞系百科全書（CCLE）癌癥細(xì)胞系的突變和RNA-Seq數(shù)據(jù)，RNA-Seq數(shù)據(jù)包含50個(gè)SCLC細(xì)胞系的測量結(jié)果，這些細(xì)胞系也被Rudin等人6分為亞型（26個(gè)SCLC-A、12個(gè)SCLC-N、4個(gè)SCLC-P和8個(gè)SCLC-Y）
4） SCLC細(xì)胞系的藥物敏感性數(shù)據(jù)：從惠康桑格研究所的FTP服務(wù)器下載，總共有38個(gè)SCLC細(xì)胞系的亞型分類是已知的，其中6個(gè)在本研究中也通過蛋白質(zhì)組學(xué)進(jìn)行了測量（缺失的細(xì)胞系：DMS153, GLC4, H1882, H372, HLHE, N417）
2、分析流程
1）RNA分離和qPCR；蛋白質(zhì)組學(xué)的樣品處理，對26個(gè)細(xì)胞系的CPs和CM進(jìn)行了處理，并進(jìn)行了基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)分析 ；納米LC-MS/MS分析
2）蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)處理：數(shù)據(jù)庫搜索在Proteome Discoverer v2.4上進(jìn)行，使用SEQUEST HT搜索引擎結(jié)合光譜庫搜索，使用UniProtKB人類數(shù)據(jù)庫和Proteome Tools光譜庫；對CP和CM樣品分別進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，為了進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對表達(dá)表進(jìn)行過濾，以獲取各樣本中有效值不低于80%的蛋白質(zhì)，結(jié)果CP和CM中分別有8405和5408個(gè)蛋白質(zhì)；分泌蛋白、細(xì)胞表面蛋白、血漿蛋白和 "可藥用 "蛋白的注釋
3）差異表達(dá)分析：蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析是通過方差分析進(jìn)行的；培養(yǎng)類型（粘附型、懸浮型）和亞型（SCLC-A, -N, -P, -Y）之間進(jìn)行了比較；CCLE RNA-Seq數(shù)據(jù)的差異表達(dá)分析是通過limma對六個(gè)亞型的比較進(jìn)行線性模型擬合；對于George等人的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集，對Z-評分值進(jìn)行了配對的Wilcoxon測試，以檢查亞型之間的基因表達(dá)差異
4）神經(jīng)內(nèi)分泌和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的評分：NE得分=（NE標(biāo)志物的平均Z-score）-（非NE標(biāo)志物的平均Z-score）；EMT得分=（間質(zhì)標(biāo)記物的平均Z分?jǐn)?shù)）-（上皮標(biāo)記物的平均Z分?jǐn)?shù)）。
5）共識聚類：使用ConsensusClusterPlus R軟件包中實(shí)現(xiàn)的共識聚類算法，以無監(jiān)督的方式對樣本進(jìn)行分組
6）基因組富集分析：通過clusterProfiler R軟件包的'GSEA'功能對所有六個(gè)亞型的比較進(jìn)行預(yù)排序的GSEA（pGSEA）；對George等人的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集進(jìn)行ssGSEA ，只使用FPKM之和大于50的轉(zhuǎn)錄本，每個(gè)基因只保留一個(gè)轉(zhuǎn)錄本
7） 稀疏偏最小二乘法判別分析：稀疏偏最小二乘法判別分析（sPLS-DA）是通過mixOmics R軟件包進(jìn)行的，對完整的CP和CM數(shù)據(jù)（過濾和估算）分別進(jìn)行了分析
三、實(shí)驗(yàn)結(jié)果
01 - 通過蛋白質(zhì)組學(xué)檢測SCLC細(xì)胞系的分子異質(zhì)性
????????作者利用無標(biāo)簽蛋白質(zhì)組學(xué)分析對26個(gè)來自原發(fā)性或轉(zhuǎn)移性人類SCLC病變的細(xì)胞系進(jìn)行了特征分析。共有10161個(gè)蛋白質(zhì)被鑒定和量化（CP和CM中分別有9570和6425個(gè)蛋白質(zhì)），這些蛋白質(zhì)中的大多數(shù)在至少80%的樣本中被量化（CP和CM中分別有8405和5408個(gè)蛋白質(zhì)）。總的來說，注釋了699個(gè)分泌蛋白，800個(gè)細(xì)胞表面蛋白，3440個(gè)可在人類血漿中檢測到的蛋白，其中367個(gè)主動分泌到血液中，以及289個(gè)"可藥用"蛋白在細(xì)胞系中。
????????首先，根據(jù)ASCL1、NEUROD1、POU2F3和YAP1的mRNA表達(dá)模式，作者將這些細(xì)胞系歸入四個(gè)相應(yīng)的亞組之一。SCLC-A、SCLC-N、SCLC-P和SCLC-Y（分別為八個(gè)、七個(gè)、四個(gè)和七個(gè)細(xì)胞系）（圖1A，上圖）。這些轉(zhuǎn)錄因子在其各自的亞型中也顯示出蛋白水平的增加（圖1A，下圖）。
????????作者發(fā)現(xiàn)Myc原癌基因（MYC）家族的幾個(gè)成員在樣本中普遍表達(dá)（圖S2a）。TP53和RB1基因的蛋白產(chǎn)物，分別在100.0%和88.5%的細(xì)胞系中被量化，與之前描述的TP53和RB1突變狀態(tài)的細(xì)胞系無關(guān)（圖S2b）。幾個(gè)公認(rèn)的亞型標(biāo)志物顯示了整個(gè)亞型的預(yù)期蛋白表達(dá)情況（圖S2c），如chromogranin-A（SCLC-A標(biāo)志物）、炭疽毒素受體1（SCLC-N標(biāo)志物）、advillin（SCLC-P標(biāo)志物）和多種整合素（SCLC-Y標(biāo)志物）（圖1B）。
????????這些細(xì)胞系通過其NE和EMT特征被進(jìn)一步描述。每個(gè)細(xì)胞系的NE分?jǐn)?shù)由19個(gè)NE和17個(gè)非NE標(biāo)記物構(gòu)成，EMT分?jǐn)?shù)由12個(gè)上皮和10個(gè)間質(zhì)標(biāo)記物構(gòu)成（圖S3a, b）。圖1D顯示了每個(gè)樣品中NE、非NE、上皮和間質(zhì)標(biāo)記物的平均蛋白豐度，而圖S3c則描述了各亞型的平均NE和EMT分?jǐn)?shù)。正如預(yù)期的那樣，大多數(shù)SCLC-A細(xì)胞系表達(dá)NE和上皮標(biāo)志物比非NE和間質(zhì)標(biāo)志物更強(qiáng)烈。SCLC-N被發(fā)現(xiàn)是一個(gè)相當(dāng)具有上皮-間質(zhì)混合特征的NE亞型。在本研究數(shù)據(jù)集中，SCLC-P表現(xiàn)出適度的非NE特征（即低于SCLC-A和-N，但高于SCLC-Y）；然而，在該亞型中檢測到上皮細(xì)胞標(biāo)記物的高表達(dá)。相反，SCLC-Y細(xì)胞系表現(xiàn)出突出的非NE和間質(zhì)特征。與這些發(fā)現(xiàn)相一致的是，delta樣蛋白3（DLL3）蛋白，一種抑制性Notch通路配體的表達(dá)量從SCLC-A到SCLC-Y逐漸減少，表明Notch通路的逐漸激活（圖S2c）。
????????比較不同性質(zhì)的細(xì)胞系之間的NE和EMT分?jǐn)?shù)，如培養(yǎng)類型、細(xì)胞系來源和化療治療，發(fā)現(xiàn)粘附型細(xì)胞系的NE分?jǐn)?shù)明顯低于非粘附型細(xì)胞系（圖S3d-f）。此外，NE和EMT分?jǐn)?shù)之間存在明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系（圖S3g）。
02 - 蛋白質(zhì)組中異質(zhì)性體外生長特征的表現(xiàn)
????????盡管在相同的體外條件下，這些細(xì)胞系表現(xiàn)出明顯不同的生長特性。具體來說，在26個(gè)細(xì)胞系中，10個(gè)（38.5%）在懸浮液中生長，3個(gè)（11.5%）以半粘附形式生長，其他13個(gè)（50.0%）在塑料上粘附生長（圖2A）。粘附和非粘附的細(xì)胞系顯示出明顯不同的蛋白質(zhì)表達(dá)譜（圖2B，C）。總的來說，與粘附在CP和CM上的細(xì)胞系相比，懸浮細(xì)胞系中有270個(gè)和148個(gè)蛋白質(zhì)明顯下調(diào)，而在CP和CM上的懸浮細(xì)胞系中有244個(gè)和244個(gè)蛋白質(zhì)明顯上調(diào)（圖2B,C，左側(cè)）。分別對CP和CM進(jìn)行差異表達(dá)蛋白的ORA，但結(jié)合上調(diào)和下調(diào)的蛋白，顯示KEGG途徑，如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、溶酶體和糖胺聚糖降解中的蛋白處理在CP和CM中都明顯富集，以及其他途徑，如CP中的內(nèi)吞作用和CM中的間隙連接被過度代表，從而支持蛋白水平上的表型細(xì)胞系差異（圖2B，C，右）。
03 - 基于蛋白質(zhì)組的SCLC亞群與基于mRNA的亞型匹配
????????為了研究蛋白質(zhì)組亞型是否與基于mRNA的分類相關(guān)，根據(jù)變化最大的蛋白質(zhì)對CP樣本進(jìn)行了無監(jiān)督共識聚類。分析顯示，蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)中有四個(gè)聚類，這與基于mRNA的亞型劃分一致（圖3A）。只有一個(gè)細(xì)胞系（H1882）發(fā)現(xiàn)了差異，根據(jù)qPCR數(shù)據(jù)被歸入SCLC-A亞組，而根據(jù)蛋白質(zhì)組學(xué)結(jié)果被歸入SCLC-P亞組。值得注意的是，該細(xì)胞系也顯示出比其他SCLC-A細(xì)胞系更高的POU2F3 mRNA表達(dá)（圖3A）。此外，兩個(gè)粘附的SCLC-A樣本（H1688，DMS53）與它們的組員相當(dāng)分離。值得注意的是，SCLC-Y樣本表現(xiàn)出最獨(dú)特的蛋白質(zhì)表達(dá)譜。之前的觀察也很好地反映在CP樣本的PCA圖上（圖3B）。另一方面，CM樣本根據(jù)其最易變的蛋白質(zhì)表現(xiàn)出相當(dāng)異質(zhì)的表達(dá)譜，PCA圖顯示根據(jù)基于mRNA的亞型分類沒有明顯的分離（圖3C）。相應(yīng)地，PVCA顯示，與CP相比，分子亞型對CM的蛋白質(zhì)表達(dá)變異性的貢獻(xiàn)不大（圖3D）。此外，培養(yǎng)類型被認(rèn)為是SCLC細(xì)胞系蛋白質(zhì)組學(xué)特征的一個(gè)重要貢獻(xiàn)者，這在CM中更為明顯。
04 - SCLC亞型的多組學(xué)圖譜概述了潛在的亞型特異性弱點(diǎn)
????????根據(jù)基于mRNA和蛋白質(zhì)組的亞型之間的高度一致性，作者使用基于mRNA的分類系統(tǒng)進(jìn)行亞型之間的差異表達(dá)分析。發(fā)現(xiàn)了367個(gè)和34個(gè)亞型特異性蛋白，在CP和CM數(shù)據(jù)中，與所有其他三個(gè)亞型相比，它們的水平分別不同。這也包括在CP數(shù)據(jù)中具有開/關(guān)特性的四個(gè)蛋白，即achae-scute homolog 1（ASCL1；在SCLC-A中 "開"）、G-蛋白信號調(diào)節(jié)器22（RGS22；在SCLC-P中 "開"）、neurexophilin-4和puratrophin-1（NXPH4和PKHG4；在SCLC-Y中 "關(guān)"）。然后對所有亞型特異性蛋白（包括來自CP和CM的蛋白）進(jìn)行了路徑分析。
????????除了確定亞型特異性蛋白外，還使用pGSEAs進(jìn)行了基于路徑的亞組比較。尋找在某一亞型中與其他三種亞型相比被一致激活或抑制的重要途徑。使用CP數(shù)據(jù)中量化的蛋白質(zhì)的完整列表（n = 8405）進(jìn)行了所有成對的亞型比較。此外，對來自CCLE的50個(gè)SCLC細(xì)胞系的RNA-Seq數(shù)據(jù)進(jìn)行了同樣的分析（n = 9237個(gè)基因），最后評估了蛋白質(zhì)組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)結(jié)果之間的關(guān)系。
????????根據(jù)亞型特異性蛋白（n = 33），SCLC-A的KEGG過程明顯過度代表，包括氧化磷酸化（OXPHOS），以及苯丙氨酸代謝和白細(xì)胞跨內(nèi)皮遷移（圖4A）。與此相一致的是，pGSEA結(jié)果也顯示基于蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)的OXPHOS和呼吸鏈元素的上調(diào)。兩個(gè)數(shù)據(jù)集都支持對神經(jīng)前體細(xì)胞增殖的正向調(diào)控，而轉(zhuǎn)錄組學(xué)則顯示SCLC-A中表皮下發(fā)育基因集的激活（圖4B）。
????????SCLC-N（n = 54）中的亞型特異性蛋白促成了KEGG途徑的明顯過度代表，如細(xì)胞周期、吞噬體、核黃素代謝和過氧化物增殖體激活受體信號途徑（圖4C）。根據(jù)pGSEA，SCLC-N可以通過抑制表皮的發(fā)育過程而得到進(jìn)一步描述。蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)還概述了免疫反應(yīng)、細(xì)胞因子信號、細(xì)胞粘附和細(xì)胞骨架組織的下調(diào)，以及轉(zhuǎn)錄和DNA復(fù)制的上調(diào)（圖4D）。考慮到SCLC-P特定的蛋白質(zhì)（n = 32），檢測到三個(gè)明顯富集的KEGG途徑，即磷脂酶D信號、溶酶體以及其他糖降解（圖4E）。此外，pGSEA顯示SCLC-P中的神經(jīng)營養(yǎng)素信號通路和薄層組織基因組被激活（圖4F）。
????????關(guān)于SCLC-Y，多個(gè)KEGG途徑在亞型特異性蛋白（n = 271）的背景下明顯過度代表，如細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）-受體相互作用、焦點(diǎn)粘附、剪接體、過氧化物酶體或O-聚糖的生物合成（圖5A）。同樣，根據(jù)pGSEA，與其他亞型相比，SCLC-Y的大量過程顯示出上調(diào)，如ECM組織、細(xì)胞因子介導(dǎo)的信號、白細(xì)胞介素信號、炎癥反應(yīng)、EMT、對生長因子的反應(yīng)、細(xì)胞-基質(zhì)粘附和絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）級聯(lián)。轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)顯示，凋亡途徑和Janus激酶-轉(zhuǎn)錄信號轉(zhuǎn)導(dǎo)劑和激活劑信號的激活，而蛋白質(zhì)組學(xué)顯示Rho-GTP酶信號的上調(diào)，以及跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)器紊亂相關(guān)過程的激活。此外，正如蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)所檢測到的，DNA修復(fù)、蛋白質(zhì)乙酰化和染色質(zhì)修飾在該亞型中被發(fā)現(xiàn)下調(diào)（圖5B）。
????????為了驗(yàn)證細(xì)胞系在SCLC組織中觀察到的亞型特異性，調(diào)查了George等人發(fā)表的SCLC組織轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)集中早期概述的亞型特異性過程的代表性基因組（n = 33）的行為，ssGSEA確定了22個(gè)基因組，其亞型特異性在組織數(shù)據(jù)中得到了一定程度的確認(rèn)（圖5C）。其中，SCLC-A的OXPHOS激活，SCLC-N的DNA復(fù)制上調(diào)和免疫反應(yīng)下調(diào)，以及SCLC-Y更活躍的EMT和抑制的DNA修復(fù)都可以被強(qiáng)調(diào)。SCLC-P的亞型特異性過程都不能通過組織轉(zhuǎn)錄組學(xué)來驗(yàn)證。
05 - 蛋白質(zhì)組學(xué)分析確定了SCLC亞型的潛在診斷標(biāo)志物和可藥用目標(biāo)
????????除了差異表達(dá)分析外，還對CP和CM分別進(jìn)行了sPLS-DA，以確定最適合根據(jù)其表達(dá)模式進(jìn)行亞型分類的蛋白質(zhì)（即潛在的IHC-或基于血液的標(biāo)記物）。分析的結(jié)果是104個(gè)蛋白質(zhì)（CP和CM數(shù)據(jù)集中分別有82個(gè)和23個(gè)；兩個(gè)數(shù)據(jù)集中都檢測到一個(gè)蛋白質(zhì)）在至少兩個(gè)亞型之間表現(xiàn)出明顯不同的特征。通過sPLS-DA選擇的蛋白質(zhì)可分為以下表達(dá)模式類別：SCLC-A相對于-N上調(diào)，SCLC-N相對于SCLC-A上調(diào)，SCLC-P（相對于其他亞型）上調(diào)，SCLC-Y上調(diào)和SCLC-Y下調(diào)（圖6A）。值得注意的是，104個(gè)蛋白質(zhì)中的35個(gè)和17個(gè)在SCLC-Y亞型中分別顯示出明顯的上調(diào)或下調(diào)。對于幾個(gè)標(biāo)志物，其表達(dá)模式與SCLC組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)相匹配（圖6B中顯示了前三名）。值得注意的是，其中8個(gè)蛋白在SCLC-Y中被發(fā)現(xiàn)過度表達(dá)，包括可能的GPX8、PDK2和AXL（圖6B）。
????????在組織轉(zhuǎn)錄組水平上確認(rèn)的蛋白質(zhì)中，有6個(gè)在人血漿中也可通過MS檢測到，即AXL（在SCLC-Y中上調(diào)）、BCAM（在SCLC-A與-N中上調(diào)。-N）、GTPBP1（在SCLC-N與-A中上調(diào)）、KRT18（在SCLC-A與-N中上調(diào)）、OLFM1（在SCLC-N與-A中上調(diào)）和PLCG2（在SCLC-P中上調(diào)）。這個(gè)名單中最有希望的血液生物標(biāo)志物是蛋白質(zhì)UFO，它以前也是通過免疫測定檢測的。
????????最后，調(diào)查了在通過差異表達(dá)分析或sPLS-DA檢測到的蛋白質(zhì)中（總共418個(gè)獨(dú)特的蛋白質(zhì)），是否能找到 "可藥用 "的蛋白質(zhì)（即FDA批準(zhǔn)的藥物目標(biāo)）。作者確定了其中的六個(gè)蛋白，作為亞型特異性治療的潛在目標(biāo)：芳香族-L-氨基酸脫羧酶（DDC，在SCLC-A中過量表達(dá)），腎上腺素A型受體2（EPHA2），整合素α-V和β-1（ITGAV，ITGB1，在SCLC-Y中過量表達(dá)），組蛋白去乙酰化酶1（在SCLC-A/N/P與SCLC-Y中過量表達(dá)）和肥大/干細(xì)胞生長因子受體Kit（KIT，在SCLC-P中過量表達(dá)）。作為其作用機(jī)制的一部分，可以劃分出多種直接與上述蛋白相互作用的藥物。此外，SCLC細(xì)胞系已經(jīng)針對其中七種藥物進(jìn)行了測試，即達(dá)沙替尼（針對EPHA2）、伏立諾他（針對HDAC1）、伊馬替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、舒尼替尼和蒂沃扎尼（均針對KIT）。因此，調(diào)查了在GDSC1或GDSC2數(shù)據(jù)集中，各亞型對這些藥物的敏感性是否有差異。根據(jù)GDSC1數(shù)據(jù)集，本研究細(xì)胞系中EPHA2、KIT和HDAC1蛋白豐度較低，表明對靶向這些蛋白的藥物的耐藥性增加（圖6C）。這一趨勢沒有被GDSC2數(shù)據(jù)集的達(dá)沙替尼所驗(yàn)證；然而，一些KIT靶向藥物（帕唑帕尼、舒尼替尼、蒂沃扎尼）的IC50中值在SCLC-P細(xì)胞系中最低，以及SCLC-Y亞型對伏立諾他的較高抗性也可以得到驗(yàn)證。
四、結(jié)論
????????通過基于MS的蛋白質(zhì)組學(xué)研究，SCLC細(xì)胞系可以被分為四個(gè)不同的亞型，這與基于qPCR的分類非常吻合。重要的是，一個(gè)獨(dú)特的YAP1驅(qū)動的亞型也可以被區(qū)分出來，具有特定的蛋白質(zhì)組學(xué)特征。對這些亞型進(jìn)行全面的蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)了這個(gè)曾經(jīng)神秘的癌癥的候選亞型特異性治療弱點(diǎn)清單。此外，還發(fā)現(xiàn)了幾個(gè)潛在的基于IHC和血液的生物標(biāo)志物，可能有助于未來的亞型診斷。
