文獻下載鏈接：Dual checkpoint blockade of CD47 and PD--L1 using an affinity--tuned bispecific antibody maximizes antitumor immunity
發表期刊：Journal for ImmunoTherapy of Cancer
影響因子：12.469
發表時間：2021年9月
單細胞轉錄組測序用于 臨床前期-藥效評估與安全性機制研究
藥物進入臨床I期實驗，招募非小細胞肺癌、頭頸部鱗癌、卵巢癌患者：（輝瑞）PF-07257876 - ClinicalTrials.gov
1. 文章摘要
作者開發了一種新的親和調節雙特異性抗體，靶向CD47和程序性死亡配體PD-L1（對PD-L1具有強親和力，對CD47具有中等親和力），以拮抗固有和適應性免疫檢查點通路。通過對小鼠、食蟹猴的抗體治療試驗的scRNA-seq分析，認為與單特異性αCD47和αPD-L1抗體聯合治療相比，αCD47/PD-L1獨特的結合選擇性導致了獨特的巨噬細胞和樹突狀細胞（DC）的激活，以及腫瘤微環境中干細胞樣祖細胞和效應CD8+ T細胞的增加。
1. 文獻背景（CD47 和 PD-L1）
1.1 PD-1/PDL1途徑
雖然阻斷PD-1或PD-L1的治療干預可以釋放抗腫瘤T細胞免疫，但在許多腫瘤患者中，免疫反應仍然受到抑制。因此對于此類患者，或許存在多個腫瘤免疫逃逸途徑，不能僅通過抑制PD-1/PDL1來解決。
1.2 CD47/SIRPα途徑
CD47是免疫球蛋白超家族中的一種細胞表面分子，是在各種惡性細胞上過表達的另一個已確定的靶點，已被通俗地描述為“不吃我”信號的調節因子。作為固有免疫抑制檢查點，當CD47與存在于各種髓系細胞上的受體SIRPα結合時，它會阻斷髓系細胞對腫瘤細胞的吞噬作用及下游的固有免疫反應的激活。在臨床前模型中，CD47過表達也被證明是對PD-1/PD-L1治療的耐藥性機制。
1.3 αCD47與αPD-1/ PD-L1聯合用藥的局限性
單特異性αCD47抗體治療在血液系統惡性腫瘤中尤其成功，如非霍奇金淋巴瘤（NHL）。不幸的是，迄今為止，即使αCD47與αPD-1/ PD-L1藥物聯合使用，在實體腫瘤患者中觀察到的療效也有限。對實體腫瘤缺乏療效的一種解釋是不能有效地靶向腫瘤，因為CD47廣泛表達于循環紅系、髓系和其他造血來源的細胞上。其高治療劑量顯示出對紅細胞的吞噬作用而導致貧血。
1.4 抗體設計亮點
作者設計了一種針對CD47和PD-L1的親和調節雙特異性抗體（BisAb），以拮抗固有和適應性免疫檢查點通路。這種新型BisAb對PD-L1具有強大的親和力，降低了對CD47的親和力。
2. 實驗結果
2.1 αCD47/PD-L1 BisAb的設計與特性分析
IC50：半抑制濃度(或稱半抑制率) ， 在結合率為50%時所對應的抑制物質的濃度就叫做IC50。一般IC50的數值越小，說明抗體的特異性能越強。
EC50：引起50%個體有效的藥物濃度，是藥物安全性指標，通常其值越大越安全。
- （1）hBisAb的設計與篩選方案：αCD47/PD-L1 BisAb為一種全人源單抗（結構如圖1A，篩選流程如圖1B），重鏈結合臂基于噬菌體展示庫技術發現。
- （2）hBisAb的特異性測試：基于細胞水平的親和力測試，判定hBisAb對CD47親和力（EC50=11.89nM），對PD-L1親和力（EC50=0.32nM）（圖1C-D）
- （3）hBisAb的安全性測試：與αCD47相比，對SIRPα存在中等強度的阻斷能力（IC50=123.6nM）（如圖1E）
- （4）hBisAb與現有PD-1藥物特異性比較：與市面上的PD-1阻斷劑atezolizumab, sasanilmab無顯著差異（如圖1F）
- （5）hBisAb對抗體依賴性細胞吞噬作用（ADCP）的影響：將人CD47+ PD-L1+腫瘤細胞和單核細胞來源的巨噬細胞進行了共培養試驗，與αhCD47或αhPD-L1單藥治療相比，hBisAb誘導腫瘤細胞吞噬作用增加，不同IgG亞型（IgG1，IgG4）對腫瘤細胞吞噬也有影響。（如圖1G）
- （6）hBisAb對DCs介導的T細胞活化的影響（混合淋巴細胞反應-MLR）：αhCD47治療減少了白細胞介素2（IL-2）的分泌；αhPD-L1單藥治療及其與αhCD47聯合治療增加了IL-2的分泌；hBisAb顯示IL-2和干擾素γ（IFNγ）分泌顯著增加，表明hBisAb在增強DC介導的T細胞活化方面具有優越的能力（圖1H）
2.2 αCD47/PD-L1 BisAb優先與腫瘤微環境中表達PD-L1的細胞結合，減少紅細胞結合
實驗設計 1 （體外試驗）：BisAb與CD47+ PD-L1+人癌細胞系HT-1080、只表達CD47的人紅細胞共培養（圖2A）
- （1）hBisAb體外優先結合測試： 與αhCD47（5F9, 2A1）相比，hBisAb與紅細胞（RBCs)的結合（EC50=7.37nM）減少了1500倍（圖2B）
考慮到hBisAb無法直接用于小鼠做體內試驗（無法實現小鼠CD47和PDL1同效率阻斷），作者又生成了針對鼠源的αCD47/PD-L1（mBisAb），效率與hBisAb相當（如圖C-D）
實驗設計 2 （體內試驗）：攜帶皮下B16F10腫瘤(免疫性冷腫瘤模型)的人FcγR小鼠在接種腫瘤后第13和16天注射人IgG同型的αmCD47、αmPD-L1、mBisAb，在第18天采集血液和腫瘤組織，小鼠體內的治療性抗體結合細胞的狀況通過流式細胞術使用抗人源IgG二抗檢測
- （2）mBisAb體內優先結合測試： αmCD47會結合大量的紅細胞而非腫瘤相關細胞；αmPD-L1同時結合腫瘤及其微環境中的相關細胞；與αmCD47相比，mBisAb顯著降低對血液紅細胞的結合，同時對腫瘤細胞和TILs的結合均顯著增加；與αmPD-L1相比，mBisAb表現出與腫瘤細胞的結合增強
2.3 αCD47/PD-L1 BisAb與αCD47和αPD-L1聯合使用相比有更好的治療效果
實驗設計 1： BALB/c小鼠CT26皮下移植（第0，3，7天注射抗體）：組1-同型抗體（對照組） 5mg/kg；組2-αmCD47 5mg/kg；組3-αmPD-L1 5mg/kg；組4-αmCD47 5mg/kg + αmPD-L1 5mg/kg；組5-mBisAb 5mg/kg；組6-mBisAb Fc-null 5mg/kg
（1）mBisAb具有更強的腫瘤生長抑制作用：mBisAb比單獨使用αmCD47或αmPD-L1抗體表現出更強的腫瘤生長抑制作用；IgG效應功能在mBisAb介導的治療效果中發揮了作用（與野生型Fc的mBisAb相比，沒有Fc版本的mBisAb表現出更低的腫瘤生長抑制）；mbisab治療組隊列的生存率（75%）與其余5組相比顯著改善--參考圖3A-C
（2）CD47靶向治療對血液紅細胞的影響：在單獨使用αmCD47和與αmPD-L1聯合治療的隊列中，小鼠紅細胞的數量顯著減少；而對照組和mBisAb沒有顯著差異，說明雙特異性靶向方法提高了抗腫瘤療效，并降低了潛在的毒性作用。（圖3D）
實驗設計 2：C57/Bl6小鼠B16F10（免疫性冷腫瘤模型）皮下移植，在植入腫瘤細胞后第9天，雌性C57/Bl6荷腫瘤小鼠接受兩種抗體治療（Isotype, mBisAb）。治療抗體劑量為20mg/kg（一周3次，注射3周）
（3）mBisAb在冷腫瘤模型同樣有效： mBisAb相比于同型對照顯著控制了腫瘤體積（圖3E）
實驗設計 3：C57BL/6小鼠MC38皮下移植后7天開始接收抗體治療（every 3–4days for 3weeks）。劑量梯度：10，20，40mg/kg
（4）mBisAb在腫瘤治療中存在劑量效應： 一定程度得加大mBisAb劑量能夠更有效得控制腫瘤體積擴增（圖3F）
實驗設計 4：在MC38荷瘤小鼠中進行基于抗體的免疫細胞消耗研究，設置5組實驗組（mBisAb同型對照，mBisAb，mBisAb+αCD8，mBisAb+αCD4，mBisAb+αCD8/4；mBisAb+αNK1.1，mBisAb+αCSF1R）
（5）CD8+細胞在mBisAb抗腫瘤調節中起到關鍵作用： 去除CD8+ 細胞后，就消除了mBisAb的抗腫瘤作用（圖3G），單獨消耗掉CD4+細胞、NK細胞、巨噬細胞都不影響mBisAb發揮作用（圖3G-I）
實驗設計 5：設置兩組MC38荷瘤小鼠（WT，Batf3-/-），BATF3已被證明可以調節CD8 T細胞記憶的產生
（6）CD8+記憶T細胞可能是mBisAb抑制腫瘤增殖的關鍵細胞群： mBisAb介導的Batf3-/-小鼠的腫瘤生長抑制被消除（圖3J），雖然在該模型不能排除BATF3缺失對T細胞的影響，但是考慮到靶向CD47的免疫調節通路依賴樹突狀細胞介導，因此后續將細胞類型聚焦在 CD8+ T細胞 和 樹突狀細胞。
2.4 αCD47/PD-L1 BisAb治療誘導了體內強大的系統性CD8+ T細胞反應和腫瘤內CD8+ T細胞增殖
實驗設計 1： MC38腫瘤模型小鼠在植入腫瘤10天后，每3-4天用同型（對照）或mBisAb治療腫瘤移植小鼠，在第15、20、25天收集腫瘤和脾臟，用質譜流式進行分析和RNA-seq（Nanostring）
（1）mBisAb治療組中激活的效應CD8+ T細胞在脾臟顯著富集：在腫瘤接種第20天，具有激活表型的CD8+ T細胞（CD44hi、CD62Llo、CX3CR1+、KLRG1+、T-bet+、Eomes+）于mBisAb治療組顯著富集（參考圖4A-B）；CD8+細胞中的效應T細胞（marker: CX3CR1, KLRG1）在腫瘤接種后第20天成比例增加，第25天仍然高于對照組（圖4C-D）
（2）mBisAb促進脾臟中遷移性cDC1的積累和系統性T細胞反應：在mBisAb處理的小鼠的脾臟中，cDC1中CD103+細胞的比例增加（圖4補充-C）；在mBisAb處理的小鼠血清中幾種促炎介質水平升高：其中包括支持CD8+ T細胞啟動和激活的關鍵細胞因子（IL-1β、IL-12和IL-18），以及關鍵的T細胞效應細胞因子IFNγ（補充表格2，在此未展示）。以上數據結果都與圖3G,J的預測吻合。
（3）mBisAb促進腫瘤組織中CD8+ T細胞/Treg比值顯著增加：mBisAb治療組中CD8+ T細胞比例較高，Treg比例相對較低（圖4E，F）。這導致mbisab治療的腫瘤中CD8+ T細胞/Treg比值顯著增加，而αmCD47或αmPD-L1治療的腫瘤中沒有增加（圖4補充D-E），這一指標與有效的抗腫瘤反應和良好的預后相關。
（4）RNA-seq揭示mBisAb增強腫瘤內CD8+ T細胞反應的機制：mBisAb治療組的腫瘤組織呈現出與CD8+ T細胞效應功能相關和抗原加工相關的基因高表達（圖4I,J）；關鍵的T細胞招募趨化因子（Cxcl9、Cxcl10和Ccl5）的水平同樣升高（圖K-M），這表明 mBisAb可以通過增強CD8+ T細胞進入腫瘤的募集和增強腫瘤抗原的呈遞來增強腫瘤內CD8+ T細胞的反應。
2.5 αCD47/PD-L1 BisAb治療調整髓系群體基因表達，并驅動TME中的固有免疫激活
實驗設計 1： MC38腫瘤模型小鼠在植入腫瘤10天后，每3-4天設置不同治療組（組1-同型對照，組2-mBisAb治療，組3-αmCD47單獨、組4-αmPD-L1單獨或組5-αmPD-L1和αmCD47聯合治療）腫瘤移植小鼠，第20天采集腫瘤和脾臟進行bulk-RNA-seq分析和scRNA-seq分析
（1）mBisAb治療的腫瘤中顯著富集固有免疫激活相關基因：（基于RNA-seq數據）I型IFN信號通路，模式識別受體（PRR）介導的IFNα誘導通路，FcγR依賴性吞噬作用相關基因顯著在mBisAb治療組富集（圖5A,B）。通過通路相關網絡分析，與αmCD47和αmPD-L1聯合治療相比，一些與先天免疫感知相關的通路（包括toll樣受體介導的信號通路），在mBisAb治療后上調的基因中特異性富集（在補充圖表，本文未提供）。因此，雙特異性靶向方法對TME有明顯的影響，而這不能通過通過單獨的CD47和PD-L1抗體阻斷來再現。
（2）巨噬細胞亞群細分：無監督聚類確定了6個單核細胞和巨噬細胞群體（圖5C），其中差異基因表達分析顯示了區分這些聚類的基因特征（圖5D）。擬時序分析發現cluster5包含經典和非經典單核細胞群，其他cluster可能代表單核來源的細胞（圖5E）。cluster1 表現出未成熟單核細胞基因（Ly6c2，Ccr2）以及成熟標記物（Itgax，Cx3cr1）的共表達；cluster 2和cluster 4 被鑒定為腫瘤相關巨噬細胞（TAM）群體，其特征是成熟巨噬細胞（Vcam1、Mertk、Apoe）和增殖巨噬細胞（Top2a、Mki67）的標記物。cluster3 明顯富含血管生成和炎癥標志物（Vegfa，Nos2，Mmp12）；cluster6 細胞表現出與免疫抑制相關的典型標記物（Mrc1，Cd200r1）的表達
（3）mBisAb治療組TAM群體表現出與抗原加工和呈遞相關的基因的相對表達增加：雖然治療后髓系cluster的相對細胞比例沒有顯著變化，但在這些治療組中觀察到明顯的基因表達變化：在mBisAb治療后，TAM群體表現出與抗原加工和呈遞相關的基因的相對表達增加，并伴隨著與細胞周期和增殖相關的基因表達的減少（圖5F）；GO通路富集分析比較了mBisAb與對照治療的腫瘤，進一步說明了mBisAb治療組在多個髓系群體中與抗原呈遞、IFN反應和補體激活相關的基因的上調（圖5G）
（4）樹突狀細胞亞群細分：無監督聚類顯示了傳統樹突狀細胞的三個亞群（cDC1、cDC2和mregDC24）（圖5H），其中差異基因表達分析顯示了區分這些聚類的基因特征（圖5I）
（5）mBisAb治療組主要誘導cDC2和mregDC表達變化：mBisAb處理誘導的基因表達變化與αmCD47和αmPD-L1聯合處理誘導的基因表達變化相似（圖5J），但是僅在mBisAb處理的cDC2亞群中觀察到與DC分化、對II型IFN的反應以及抗原加工和呈遞相關的基因的相對表達增加(圖5K）；同時與其他處理相比，mBisAb給藥誘導的基因表達變化主要與mregDC亞群內的翻譯調控有關（在補充圖表，本文未提供）
2.6 αCD47/PD-L1 BisAb治療增加了腫瘤中干細胞樣祖細胞和效應CD8+ T細胞亞群比例，并促進了CD8+ T祖細胞分化為效應樣狀態
實驗設計如2.5 利用scRNA-seq數據集來進一步了解mBisAb治療如何影響TME內的CD8+ T細胞
（1）腫瘤CD8+ T細胞亞群細分：鑒定了6個不同的腫瘤內CD8+ T細胞簇（圖6A），確定了每個cluster相對于所有其他腫瘤內CD8+ T細胞簇有差異表達的基因（圖6B）；cluster 1為干細胞樣祖細胞樣CD8+ T細胞 （轉錄因子Tcf7和趨化因子受體Cxcr3高表達），這一群體已被證明在維持有效的抗腫瘤T細胞反應中發揮了關鍵作用，并與改善對檢查點封鎖治療的反應性相關；cluster2為末端耗盡T細胞 （Cd244和Ptpn6的表達相對較高），同時高表達T細胞衰竭相關基因（Pdcd1和Havcr2）；cluster3 雖然也高表達T細胞衰竭相關基因，但CD8+ T細胞效應功能相關基因同樣高表達，包括IfngPrf1（編碼穿孔素），在促進DC和巨噬細胞招募，成熟和激活起重要作用的趨化因子（Ccl4和Ccl3），和Cx3cr1（慢病毒感染后存在高效應功能的T細胞marker）。
（2）mBisAb治療組cluster1和3顯著富集：值得注意的是，與αCD47和αPD-L1單治療或聯合治療相比，mBisAb治療特異性增加了cluster1干樣祖細胞和cluster3效應樣CD8+ T細胞的比例（圖6C）
（3）CD8+ T細胞cluster1在不同治療組差異表達：在mBisAb治療后，CD8+ T細胞cluster1下調的特定基因包括與幼稚T細胞狀態相關的基因，如轉錄因子Tcf7、Lef1和Bach2；上調的基因包括與效應CD8 T細胞功能和命運相關的基因，如顆粒酶（Gzmb，Gzmk）、免疫細胞招募趨化因子（Ccl5）和轉錄因子Tbx21和Id2（圖6D）。差異表達基因的GO富集分析發現，除αmCD47治療組之外，其余3種治療方式（αmPDL1，αmPDL1+αmCD47聯合，mBisAb）的cluster1高表達基因顯著富集在T細胞分化和效應功能通路，包括細胞對IFNγ的反應，細胞溶解和T細胞介導的細胞毒性；而以下通路僅顯著富集在mBisAb治療組（調節T細胞的激活，正向調節TNF的產生，正向調節I型IFN介導的信號轉導）（圖6E）
（4）mBisAb治療擴大了具有高效應潛能的細胞群體：mBisAb治療誘導CD8+ T細胞從幼稚狀態到效應狀態的分化相關途徑的基因表達富集（圖6F），mBisAb治療比αmCD47或αmPD-L1單藥治療及其聯合治療更能誘導這一結果
（5）脾臟CD8+ T細胞亞群細分： 在脾臟內發現了四種不同的CD8+ T細胞簇，為了闡明每個cluster的細胞類型，確定了每個聚類相對于所有其他脾臟CD8+ T細胞簇的差異表達的基因(圖6G）；cluster 1 幼稚T細胞（Lef1、Tcf7、Sell和Il7r）；cluster 2 記憶T細胞（Cd44、Ly6c2、Eomes和Il2rb）；cluster 3 增殖T細胞（Mki67和Top2a）；cluster4 效應T細胞，包括關鍵譜系定義轉錄因子（Tbx21、Zeb2和Id2）、效應分子（Gzma、Gzmb、Gzmk）和趨化因子受體（Ccr5、Cxcr3、Cx3cr1）高表達
（6）mBisAb治療誘導了強大的系統性和腫瘤內的T細胞反應：除αmCD47治療組之外，其余治療組與對照相比顯著提高了增殖T細胞和效應T細胞的比例；mBisAb治療組脾臟CD8+ T細胞增殖效應顯著高于PD-L1治療組，這些數據與CyTOF和流式細胞術數據一致（圖6H）
2.7 αCD47/PD-L1 BisAb可同時調節食蟹猴的固有免疫和適應性免疫
實驗設計 1： 旨在探索hBisAb的毒性譜和潛在的藥效學標志物
食蟹猴 每周靜脈注射10、30或100mg/kg的hBisAb，持續2周（設置vehicle注射作為對照），多個時間點收集外周血樣本用于RNA-seq分析
（1）指定劑量的hBisAb對NHP沒有顯著副作用：在2周的給藥期間，紅細胞和血小板的細胞量保持在歷史對照的范圍內，沒有發現不利影響（圖7A，B）
（2）hBisAb可以顯著提升NHP血液中T細胞比例：給藥hBisAb后的NHPs顯示CD25+ CD8+ T細胞（圖7C）和CD69+ CD4+ T細胞（圖7D）顯著增加。
（3）hBisAb顯著富集NHP的固有免疫激活相關途徑基因：hBisAb處理增加了I型IFN信號通路（STAT1、BATF2、IRF7、RSAD2、IFIT3）和髓系細胞激活（CD80、MX1、TMEM173、DDX58）相關基因的表達(圖7E）；IFN信號和PRR介導的固有免疫反應是hBisAb治療組中富集強度最高的通路(圖7F）；在所有免疫亞群中，活化的樹突狀細胞和M1巨噬細胞表型是hbisab處理的樣本中相對于對照載體最豐富的基因特征（圖7G，H）；這些數據與小鼠模型中的TME數據一致，也有臨床數據證明，固有免疫調節，特別是I型IFN反應，使腫瘤對當前的免疫檢查點抑制劑敏感。
（4）hBisAb治療誘導了NHP體內強大的系統性和T細胞反應：：許多與T細胞激活相關的基因（CD28、ICOS、LAG3、CTLA4）和細胞遷移（CXCL10、CCR7）相關的基因在hBisAb治療組中富集(圖7E）
實驗設計 2： 構建抗體hBisAb2（CD47親和力降低）；食蟹猴 每周靜脈注射hBisAb和hBisAb2，收集外周血樣本用于RNA-seq分析
（5）CD47臂是hBisAb誘導強大的固有免疫激活的主要驅動因素：hBisAb處理的樣本中與I型IFN信號通路和髓系細胞激活相關的通路明顯富集（圖7I）；hBisAb誘導了幾個關鍵的固有免疫調節基因的上調，而這些基因并未隨hBisAb2誘導顯著上調（圖7J）。
3. 亮點總結
（1）設計中等親和力的CD47和高親和力的PD-L1的雙特異性，與外周血相比顯著提高了抗體對TME的選擇性
（2） 在同基因腫瘤模型中，雙特異性治療比αCD47、αPD-L1單藥治療產生了更有利的治療窗口
（3）在小鼠和NHP系統中發現了雙特異性治療后獨特的髓系和T細胞激活模式，證明了其能夠參與固有免疫和適應性免疫應答以獲得抗腫瘤療效
