Combined Alcohol Exposure and KRAS Mutation in Human Pancreatic Ductal Epithelial Cells Induces Proliferation and Alters Subtype Signatures Determined by Multi-Omics Analysis
人類胰腺導管上皮細胞的酒精暴露和KRAS突變共同誘導增殖并改變由多組學分析確定的亞型特征
發表期刊：Cancers (Basel)
發表日期：2022 Apr 13
DOI:? 10.3390/cancers14081968
一、背景
????????胰腺導管腺癌目前是美國癌癥相關死亡的第四大原因，患者的5年生存率只有10%，部分原因是其高轉移率和治療抗性。改善PDAC患者的生存狀況需要詳細了解影響疾病進展和治療反應的基本分子特征。有研究發現，PDAC的4種不同亞型（代謝性，祖細胞樣，增殖性和炎癥性）可以為精準治療提供途徑，因為亞型可以預測治療反應。然而，影響不同PDAC亞型發展的遺傳和環境因素需要額外的評估。
????????PDAC中四個最常突變的基因是KRAS，TP53，CDKN2A和SMAD4。超過90%的PDAC有KRAS的激活突變。KRAS是PDAC中最常觀察到的突變，但在其他癌癥類型中經常觀察到其他RAS / RAF / MAPK途徑成員的失調和突變。野生型KRAS PDAC腫瘤通常通過BRAF突變顯示MAPK途徑的激活，這表明KRAS和BRAF突變可以在MAPK途徑的激活中相互補償。因此，PDAC高度依賴于MAPK途徑的激活來驅動增殖并啟動癌變。
????????有幾個潛在的原因和危險因素與PDAC的發展有關，包括PDAC的家族史、慢性胰腺炎、吸煙、糖尿病、肥胖和飲酒，但它們與該疾病的某些亞型的發展的關系還不明確。最近的證據表明，在KRAS突變的情況下，酒精攝入會促進PDAC的發展，這表明內在和外在的因素共同影響PDAC發展。
二、材料與方法
1、數據來源
1） 細胞：HPNE（人胰腺巢蛋白表達）細胞；HPNE-KRAS細胞含有一個組成活性的KRAS G12D突變
2） 通過 cBioportal 訪問來自 TGCA Firehose Legacy 的 PDAC 患者的 SERPINE1 蛋白表達數據
2、分析流程
1）細胞培養、 增殖試驗、Caspase-3 凋亡試驗、細胞周期分析、乙醛檢測、細胞ROS的測量、細胞ROS的測量
2） 蛋白質實驗：肽的制備、TMT標記、LC/MS-MS和蛋白質鑒定
3） 差異表達：在DESeq2歸一化之后，RNA-Seq轉錄本按生物類型（Ensembl）進行分類；R被用來生成RNA序列和蛋白質組學數據集的分層聚類熱圖
4） GO術語分析：RNA Seq和蛋白質組學數據的GO術語分析是通過DAVID生物信息學使用過濾的GO FAT本體術語（不包括背景集）完成的
5） 多重共慣性分析：多重共慣性分析在R語言中使用omicade4軟件包完成
6） 差異性共表達：為了研究哪些蛋白質在HPNE中協調表達，以及乙醇和突變的KRAS如何改變協調表達的蛋白質，進行了差異性共表達分析
7） 定量反轉錄聚合酶鏈反應（qRT-PCR）、蛋白質印跡、化療藥物治療和活力測定
三、實驗結果
01 - 慢性乙醇處理促進了KRAS突變HPNE細胞的增殖
????????本研究使用了未轉化的人胰腺巢蛋白表達（HPNE）和突變的KRAS G12D轉化的HPNE（HPNE-KRAS）細胞，以評估酒精在與胰腺癌最常見早期突變事件有關的特定細胞和遺傳背景下的影響。由于個體之間行為的可變性，人類的酒精使用很難建模。酒精暴露發生在數年和十年內，并可能通過慢性和/或急性暴露影響分子、細胞或組織。為了在6個月的短時期內建立酒精暴露的模型，作者用100mM EtOH每2-3天處理一次HPNE和HPNE-KRAS細胞。這使作者能夠檢查乙醇暴露對野生型KRAS和組成型活性KRAS（G12D）表達的胰腺細胞的影響。乙醇處理6個月后，評估了細胞增殖的表型變化，并進行了蛋白質組和轉錄組的多組學分析（圖1A）。
????????HPNE和HPNE-KRAS細胞都能耐受乙醇暴露，在治療期間沒有觀察到明顯的細胞死亡。在開始乙醇處理6個月后，HPNE細胞在對照和乙醇處理條件下的增殖沒有表現出任何差異（圖1B）。然而，與對照組細胞相比，用乙醇處理的HPNE-KRAS細胞顯示出其增殖率的明顯增加（圖1C）。對這些細胞在培養中的倍增時間的分析證實，與對照組相比，EtOH處理促進了HPNE-KRAS的快速生長（圖1D）。與未經處理的HPNE-KRAS對照組細胞相比，EtOH處理的HPNE-KRAS細胞的增殖與處于G1期的細胞百分比的增加有關，而處于G2期和S期的細胞數量較少。而在用EtOH理的HPNE細胞中，與未處理的HPNE細胞相比，G1期的細胞減少，G2和S期的細胞增加（圖1E）。
????????在乙醇條件的HPNE-KRAS細胞培養物中觀察到的迅速擴大的細胞群也可能是受細胞死亡率變化的影響。慢性乙醇處理已被證明能誘導各種非轉化細胞類型，包括β細胞和T細胞的Caspase-3激活和凋亡。對照組和EtOH處理的HPNE細胞之間的caspase-3活性沒有差異。然而，EtOH處理的HPNE-KRAS細胞在穩態培養中顯示出caspase-3活性的下降（圖1F）。這些結果共同表明，細胞周期的變化和凋亡率的降低導致EtOH處理的HPNE-KRAS細胞的群體倍增時間縮短。
02 - 突變體KRAS和乙醇處理會增加核糖體和RNA代謝基因的表達
????????對HPNE細胞系進行RNA-Seq分析，以鑒定受KRAS突變和EtOH暴露影響的基因表達特征，確定了6個表達相似的基因簇（圖2A）。與野生型HPNE細胞相比，在HPNE-KRAS突變體細胞的背景下，觀察到由于EtOH調節導致基因的表達倍數變化差異更大（圖2B）。與HPNE細胞（3105個轉錄本）相比，HPNE-KRAS細胞還表現出與EtOH處理有關的更多不同表達的轉錄本。僅在蛋白質編碼基因中，有997個基因的倍數變化為2或更大，而728個基因的倍數變化為-2或更低。在HPNE EtOH和HPNE-KRAS EtOH細胞中，有184個普遍上調的基因和179個普遍下調的基因（圖2C），表明EtOH調節對這些基因的調控有保守的影響，與KRAS突變狀態無關。然而，1635個上調和1388個下調的基因與HPNE-KRAS細胞的EtOH處理有獨特的聯系，而HPNE細胞的EtOH調理則有303個上調和280個下調的基因（圖2C）。這些結果共同表明，胰腺細胞中潛在的KRAS突變可能加劇長期乙醇暴露引起的基因表達失調。
????????為了評估這些不同表達的蛋白編碼基因的共同特征，使用DAVID對HPNE（圖2D,E）和HPNE-KRAS（圖2F,G）細胞系進行了GO富集分析。與HPNE細胞中EtOH調節相關的上調基因集富集對應于細胞外區域和質膜組分的細胞組分（CC），同時鑒定出用于受體結合，鈣離子結合和生長因子活性的富集分子功能（MF）（圖2D）。在HPNE細胞中與EtOH調節相關的下調基因中，富集GO項是BP類別中的細胞表面受體信號傳導，細胞或亞細胞組分的運動以及CC類別中的質膜成分（圖2E），類似于在上調基因集中觀察到的結果。在EtOH條件的HPNE-KRAS細胞中，上調基因在BP類別中靶向質膜和ER項的蛋白質中富集，CC類別中的核糖體組分項以及MF類別中的rRNA代謝/處理項（圖2F）。在HPNE-KRAS乙醇處理細胞中下調的基因在細胞外基質和結構組織以及細胞 - 細胞信號傳導（BP）中富集;質膜和細胞外基質成分，神經元和突觸部分（CC）;鈣離子結合，受體結合和活性以及糖胺聚糖結合（MF）（圖2G）。KRAS突變和EtOH處理對核糖體基因表達的綜合影響表明，蛋白質表達譜可能受到影響。
03 - 突變的KRAS和乙醇處理增加了核糖體和RNA處理蛋白
????????為了描述EtOH和KRAS突變對HPNE細胞的蛋白質水平的影響，作者使用了定量蛋白質組學，每個條件有3個生物重復。檢測了3861個蛋白質。將每種條件下至少具有3個重復值中的2個的蛋白質納入進一步分析。在HPNE和HPNE-KRAS細胞中，共有3167和3210個蛋白質分別符合這些要求（圖3A）。使用主成分分析（PCA）來可視化每個樣品蛋白質組的變化和模式（圖3B）。與未經處理的HPNE細胞相比，EtOH處理對蛋白質組的變化影響相對較小。然而，與未經處理的HPNE-KRAS對照細胞相比，突變KRAS表達背景下EtOH處理對蛋白質組的變化有較大影響（圖3B）。與RNA-seq的結果一樣，與HPNE相比，EtOH處理對HPNE-KRAS細胞的蛋白質表達差異有較大的影響。在±1.25的倍變閾值和FDR≤0.05來定義差異表達的蛋白質時，與未處理的HPNE-KRAS細胞相比，132種蛋白質（95種上調和37種下調）在HPNE-KRAS EtOH中差異表達（圖3C）;然而，在HPNE細胞中沒有蛋白質達到這個FDR閾值。
????????通過DAVID進行GO術語富集分析，以確定與HPNE和HPNE-KRAS細胞系中不同表達的蛋白質相關的重要術語（圖3D-G）。富含HPNE EtOH上調蛋白的生物過程（BP）項主要與RNA處理和剪接有關，細胞組分（CC）項包括核糖核蛋白和剪接體復合物，分子功能項（MF）包括參與細胞 - 細胞粘附的鈣粘蛋白結合，以及poly（A）和RNA結合（圖3D)。在用EtOH處理的HPNE細胞中，下調蛋白的首要條件是生物體（BP）細胞外細胞器（CC），氧化還原酶和蘇氨酸型內肽酶活性（MF）之間的細胞間相互作用（圖3E）。Poly（A）和RNA結合也是與下調蛋白和上調蛋白相關的重要術語。與RNA Seq數據一樣，觀察到在HPNE-KRAS EtOH上調和下調的蛋白質中，所有三個GO類別都有更多的富集術語（圖3F,G）。上調的蛋白質富集于蛋白質靶向ER和核糖體；與翻譯、rRNA/RNA處理和結合有關的功能經常出現在GO術語結果中（圖3F）。下調的基因富集在細胞外結構組織、質膜成分和鈣離子結合方面（圖3G）。
04 - 慢性乙醇調理后，乙醇代謝受到輕微的影響
????????在高濃度乙醇的條件下，乙醇可以被CYP2E1（細胞色素P450 2E1）代謝，它產生的ROS是反應的副產品，有可能對DNA和蛋白質造成損害，從而促進癌癥的發展（圖4A）。因此，作者測量了用EtOH調理的HPNE和HPNE-KRAS的基線乙醛和ROS水平，與類似的未處理的對照細胞相比，以及它們對急性EtOH刺激（測量前100mM培養1小時）的反應。雖然急性EtOH刺激增加了乙醛的產生，但在不同的細胞系之間沒有觀察到乙醛濃度的明顯差異，不管EtOH調節狀態如何（圖4B）。同樣，除了非乙醇處理的HPNE-KRAS細胞在急性乙醇刺激后表現出ROS水平的增加外，不同的細胞系之間的ROS水平也沒有急劇變化（圖4C）。乙醛和ROS的產生缺乏明顯的變化，這也反映在蛋白質組數據中。在蛋白質組學實驗中檢測到的與乙醛代謝有關的大多數酶在HPNE和HPNE-KRAS細胞中的表達水平相似，并且不受乙醛調節的影響（圖4D）。例外的是AKR1A1和ALDH1B1，它們分別在EtOH條件的HPNE-KRAS細胞中下調或上調（圖4D）。ALDH1B1和突變KRAS被認為與驅動PDAC的開始有關?？傊?，這些結果表明，在HPNE-KRAS細胞中，與EtOH調節有關的表型變化可能不是由于與EtOH代謝途徑有關的適應性。
05 - 用乙醇處理的突變體KRAS細胞顯示出RNA和蛋白質表達之間的相關性增加
????????進行多重共性分析（MCIA）來觀察每個樣品的RNA-Seq和蛋白質組學數據之間的關系。在HPNE、HPNE EtOH和HPNE-KRAS條件下，RNA-Seq和蛋白質組學數據有所不同，如類似條件下數據類型點的分離度增加所描繪的（圖5A）。有趣的是，HPNE-KRAS EtOH RNA-Seq和蛋白質組學數據表現出高度的相似性，表明這些細胞的轉錄和翻譯過程之間的相關性增加。
????????使用HPNE-KRAS EtOH數據集，作者在RNA-Seq和蛋白質組學數據集中鑒定出44種轉錄本和蛋白質，這些轉錄本和蛋白質一致地上調（n = 33）或下調（n = 11）（圖5B，C）。選擇在增殖過程中具有已知功能的基因/蛋白，包括PRP19、CD81、ZPR1、RUVB1、RHOG和NT5E，通過q-RT-PCR和Western blot分析來驗證RNA-Seq和蛋白組學數據（圖5D-I）。CD81（圖5D），RHOG（圖5E），ZPR1（圖5F），RUVBL1（圖5G）和PRPF19（圖5H）的蛋白質和mRNA水平在HPNE-KRAS細胞中響應EtOH調節而增加，而NT5E（圖5I）mRNA降低，這些細胞中的蛋白質水平僅略微降低。這些結果與蛋白質組學和RNA-Seq數據基本一致（圖5C由基因/蛋白質名稱前面的星號表示）。
06 - SERPINE1是EtOH調理的HPNE-KRAS細胞中特有的高度相關的蛋白質
????????為了確定蛋白質之間潛在的重要調節關系，作者進行了差異化的共表達分析，重點關注EtOH條件下的HPNE-KRAS。確定了哪些蛋白質被共同表達，以及在突變體KRAS表達和EtOH處理的情況下共同表達如何變化?？偣泊_定了287種具有561個正或負相關的蛋白質（圖6A）。在許多情況下，在HPNE-KRAS EtOH細胞中發現了具有正相關的蛋白質-蛋白質對，但在HPNE、HPNE EtOH和HPNE-KRAS細胞中發現這些相同的蛋白質對是負相關的或不相關的。同樣，在HPNE-KRAS EtOH細胞中表現出負相關的蛋白質-蛋白質對，在HPNE、HPNE EtOH和HPNE-KRAS細胞中可以發現正相關或不相關。
????????有幾個高度相關的蛋白質在組合網絡中被確定為負相關和正相關，包括纖溶酶原激活物抑制劑1（PAI1，又名SERPINE1）（圖6B,C）。SERPINE1是一種絲氨酸蛋白酶抑制劑，被大多數人類癌細胞系過度表達，被認為通過細胞周期進展刺激生長，并通過激活蛋白酶活化受體（PAR）間接刺激生長。根據Fisher's Exact Score，確定了與SERPINE1有正相關或負相關的蛋白質的前五個GO/KEGG通路術語（圖6C）。與 SERPINE1 正相關網絡蛋白相關的最重要的術語之一是“酗酒”。SERPINE1負相關網絡的另一個重要術語是 "丙酮酸代謝過程"（圖6C）。乙醇分解和丙酮酸鹽均產生乙酰輔酶A，丙酮酸隨乙醇暴露而降低。SERPINE1的差異共表達網絡表明該蛋白可以作為調節胰腺細胞對乙醇暴露反應的 "樞紐 "蛋白。事實上，來自PDAC患者的TCGA數據對酒精攝入頻率的注釋表明，SERPINE1蛋白的表達與酒精使用頻率的增加呈負相關（圖6D）。同樣，蛋白質組學數據顯示，與未經處理的HPNE-KRAS EtOH細胞相比，SERPINE1的表達明顯下降（圖6E）。此外，SERPINE1的低表達與PDAC患者的明顯生存優勢有關（圖6F）?？傊?，這些結果表明，SERPINE1是HPNE-KRAS細胞中受酒精暴露調節的蛋白質網絡中的一個高度互連的節點，這可能對患者的生存有影響。
07 -乙醇處理改變了 PDAC 亞型
????????先前在轉移性PDAC組織中的蛋白質組學觀察表明，這些患者的酒精使用與炎癥亞型的減少以及增殖性和代謝亞型的增加有關。為了確定在HPNE細胞系中存在或不存在突變的KRAS時，EtOH對亞型特征的影響，作者評估了具有或不具有EtOH調節的每種HPNE和HPNE-KRAS細胞系的PDAC亞型特征（圖7A-D）。EtOH對HPNE細胞的亞型特征沒有明顯影響。然而，HPNE-KRAS EtOH細胞的增殖性（圖7A）和代謝性（圖7C）亞型特征明顯增加，炎癥性亞型特征明顯減少（圖7B）。值得注意的是，在HPNE-KRAS細胞中，對EtOH調理反應的亞型特征的變化最明顯的是炎癥性特征的抑制和代謝性特征的增加（圖7B，C）。表明EtOH對PDAC亞型發展的影響可能取決于KRAS的突變狀態。
????????此外，以前的研究確定，對FOLFIRINOX療法的臨床反應也與PDAC亞型有關。由于對EtOH調理的亞型特征的轉變也可能影響對治療藥物的反應，作者分析了三種常用的胰腺癌藥物（吉西他濱、伊立替康和奧沙利鉑）對細胞活力的影響（圖7E-G）。與對照組HPNE細胞相比，EtOH處理HPNE細胞導致吉西他濱處理的EC50較低，但在該細胞系中沒有觀察到伊立替康或奧沙利鉑處理對EC50的影響。然而，與對照組HPNE-KRAS細胞相比，吉西他濱（圖7E）、伊立替康（圖7F）和奧沙利鉑（圖7G）的EC50s在HPNE-KRAS EtOH細胞中明顯降低。這些結果與預期一致，即隨著細胞獲得代謝特征并失去炎癥特征，治療反應將得到改善。
四、結論
????????這項研究確定，酒精優先誘導和增加表達突變KRAS的胰腺HPNE細胞的增殖潛力。研究表明，酒精對胰腺細胞的影響取決于細胞的KRAS突變狀態。結合起來，酒精和突變的KRAS會增強增殖表型，并影響與轉錄組和蛋白質組的改變相關的亞型劃分。
