這一篇繼續(xù)學(xué)習(xí)一些免疫方面的內(nèi)容，參考文獻(xiàn)在Global analysis of shared T cell specificities in human non-small cell lung cancer enables HLA inference and antigen discovery，2021年3月發(fā)表于Immunity，，免疫是一門很深的學(xué)問，之前分享了很多了，但是還是盲區(qū)太多，看來免疫學(xué)作為一門專門的學(xué)科大類是有道理的。
Highlights
- The algorithm GLIPH2 enables analysis of shared TCR specificity and HLA prediction
- Tumor-infiltrating T cells cross-react to EBV antigens and shared tumor antigens
- EBV-specific T cells expanded in patients responding to immune checkpoint blockade
- Cross-reactive CD8 T cells express GZMK
Summary
為了識別具有共享抗原特異性的疾病相關(guān) T 細(xì)胞受體 (TCR)，使用 GLIPH2（grouping of lymphocyte interactions with paratope hotspots 2）算法分析了來自 178 名非小細(xì)胞肺癌患者的 778,938 個(gè) TCRβ 鏈序列。分析確定了超過 66,000 個(gè)共享特異性組，其中 435 個(gè)與鄰近肺相比，在腫瘤中克隆擴(kuò)增并富集。使用酵母肽-HLA A*02:01 展示文庫鑒定了這樣一個(gè)富含腫瘤的特異性組的抗原表位。這些包括來自上皮蛋白 TMEM161A 的肽，它在腫瘤中過度表達(dá)，以及來自 Epstein-Barr 病毒和大腸桿菌的交叉反應(yīng)表位。研究結(jié)果表明，這種交叉反應(yīng)可能是腫瘤浸潤物中病毒特異性 T 細(xì)胞存在的基礎(chǔ)，并且病原體交叉反應(yīng)可能是多種癌癥的特征。在這項(xiàng)工作中產(chǎn)生的方法和分析管道，以及這里定義的特異性組，為了解癌癥中的 T 細(xì)胞反應(yīng)提供了資源。
Introduction
盡管廣泛使用免疫療法治療癌癥，但我們對這種疾病中 T 細(xì)胞特異性的了解非常有限。 抗原特異性是 T 細(xì)胞功能的關(guān)鍵決定因素，但 T 細(xì)胞受體 (TCR) 多樣性和人類白細(xì)胞抗原 (HLA) 等位基因多態(tài)性帶來的挑戰(zhàn)一直是了解腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞識別的全部抗原的主要障礙。 已經(jīng)描述了識別突變蛋白（即新抗原）、非突變腫瘤相關(guān)抗原 (TAA) 和病毒抗原的腫瘤浸潤 T 細(xì)胞。 在沒有已知病毒病因的腫瘤中，先前的報(bào)告已經(jīng)確定了浸潤腫瘤的病毒特異性 T 細(xì)胞，包括識別流感 (flu)、愛潑斯坦-巴爾病毒 (EBV) 或巨細(xì)胞病毒 (CMV) 的 T 細(xì)胞。 在這些腫瘤中，病毒特異性腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞被認(rèn)為不識別腫瘤抗原，通常被稱為“bystander cells”。
在尋找 TAA 方面，新一代測序已經(jīng)能夠?qū)δ[瘤浸潤性 T 細(xì)胞中的大量 TCR 可變區(qū)進(jìn)行快速測序，但在利用生成的數(shù)據(jù)方面仍然存在挑戰(zhàn)。 這部分是由于成百上千個(gè)不同的 TCR 序列可以識別相同的肽-主要組織相容性復(fù)合體 (MHC) 配體。 為了將這種巨大的序列多樣性減少到更少的特異性，作者開發(fā)了一種算法 GLIPH（通過互補(bǔ)位熱點(diǎn)對淋巴細(xì)胞相互作用進(jìn)行分組）和改進(jìn)版本 (GLIPH2)，它將大量 TCR 序列解析為共享的特異性組 極有可能識別相同的肽-MHC 配體。 這些共享的特異性組是基于相同的氨基酸序列motif或 TCRβ 鏈的互補(bǔ)決定區(qū) 3 (CDR3) 內(nèi)的強(qiáng)同源性建立的。 （這個(gè)是目前TCR研究的主要方向）。
在這里，使用 GLIPH2 從 178 名可手術(shù)切除腫瘤的非小細(xì)胞肺癌 (NSCLC) 患者中發(fā)現(xiàn)的 778,938 個(gè) CDR3β 序列中識別出超過 66,000 個(gè)高質(zhì)量的共享特異性組。與相鄰肺組織相比，435 個(gè)共享特異性組在腫瘤中被克隆擴(kuò)增。其中，包含“S%DGMNTE”序列motif的 CDR3β 序列優(yōu)先用于使用 HLA-A*02 酵母展示文庫進(jìn)行抗原發(fā)現(xiàn)，其中“%”表示不同的氨基酸。具有“S%DGMNTE CDR3β”motif的 T 細(xì)胞對非突變腫瘤抗原 TMEM161A 以及來自 EBV 和大腸桿菌的抗原有反應(yīng)，表明 T 細(xì)胞與 TAA 和常見病原體具有交叉反應(yīng)性。此外，我們發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性抗原和 EBV 表位之間交叉反應(yīng)的第二個(gè)例子，以及另外兩個(gè)例子，其中 EBV 特異性 CDR3β 序列在對抗 PD-1 治療有臨床顯著反應(yīng)的患者中進(jìn)行了克隆擴(kuò)增。這表明病原體交叉反應(yīng)性可能是瘤形成和 T 細(xì)胞免疫相互作用的一個(gè)重要特征。總體而言，此處介紹的方法能夠?qū)θ祟惏┌Y中共有的 T 細(xì)胞特異性進(jìn)行綜合分析，并使用酵母展示庫識別特定抗原，并更廣泛地應(yīng)用于其他癌癥類型。
Results
Defining shared specificity groups for tumor-infiltrating T cells in human lung cancer
如前所述，GLIPH2 基于局部motif和/或全局同源性識別極有可能具有共享肽-MHC 特異性的 CDR3β 序列。 為了識別識別肺癌中共享腫瘤抗原的 T 細(xì)胞，將 GLIPH2 應(yīng)用于最近發(fā)表的 MD Anderson 癌癥中心 (MDACC) 數(shù)據(jù)集，該數(shù)據(jù)集包含來自 NSCLC 腫瘤和鄰近肺部的 778,938 個(gè)不同的 CDR3β 序列。 該臨床隊(duì)列代表 178 名患有可手術(shù)切除的疾病且具有可用 HLA 數(shù)據(jù)的患者。 我們首先用一組特定的過濾標(biāo)準(zhǔn)定義了共享特異性組，并確定了 66,094 個(gè)共享特異性組。 為了關(guān)注與疾病最相關(guān)的 TCR，我們進(jìn)一步確定了 4,226 個(gè)具有克隆擴(kuò)增證據(jù)的特異性組，其中 435 個(gè)與相鄰肺相比富含腫瘤。 因此，推斷這 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組的 CDR3β 成員識別尚未發(fā)現(xiàn)的 TAA。
接下來，推斷識別共享腫瘤抗原的 T 細(xì)胞會在 NSCLC 患者中進(jìn)行克隆擴(kuò)增，但不會在沒有癌癥的個(gè)體中進(jìn)行。 分析觀察到，與其余擴(kuò)增較少的 TCR 相比，屬于 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組的 MDACC NSCLC 隊(duì)列中擴(kuò)增的 CDR3β 克隆的百分比顯著更高。 在來自代表 68 名 NSCLC 患者的 202 個(gè)腫瘤樣本的 1,173,806 個(gè) CDR3β 序列的驗(yàn)證隊(duì)列中進(jìn)行了類似的觀察。 相比之下，癌癥患者的相鄰肺（未受腫瘤累及）、健康供體的肺或慢性阻塞性肺病（COPD）患者的肺（無癌癥診斷）具有較少的屬于富含腫瘤的特異性組的 CDR3β 克隆。 總之，這些數(shù)據(jù)表明 GLIPH2 成功地將大量 CDR3β 序列數(shù)據(jù)集解析為數(shù)百個(gè)與 NSCLC 疾病相關(guān)的富含腫瘤的特異性組。
Viral specificity group inferences from HLA tetramer datasets
為了驗(yàn)證由 GLIPH2 建立的共享特異性組，將來自公開可用 HLA 四聚體數(shù)據(jù)庫的 CDR3β 序列與 MDACC CDR3β 序列結(jié)合起來進(jìn)行聯(lián)合 GLIPH2 分析。公開可用的四聚體 CDR3β 序列主要涵蓋病毒特異性，并在實(shí)驗(yàn)中顯示在其各自 HLA 的背景下結(jié)合表位。這使我們能夠用 CDR3β 序列在其 HLA 的背景下與獨(dú)特的表位相連來注釋一些特異性組，從而推斷其余 CDR3β 成員的共享特異性。聯(lián)合分析注釋了 66,094 個(gè)共享特異性組中的 394 個(gè)。在這些特異性組中，71 個(gè)被克隆擴(kuò)增并用 10 個(gè)不同的四聚體進(jìn)行了注釋。我們發(fā)現(xiàn)，與鄰近肺相比，對流感、EBV 或 CMV 衍生抗原具有推斷特異性的 CDR3β 序列在腫瘤中總體上沒有表現(xiàn)出偏差。此外，這些病毒特異性 CDR3β 克隆的估計(jì)頻率遠(yuǎn)高于初始水平（每 105-106 個(gè)），并且與先前報(bào)告的通過 HLA 四聚體染色測量的范圍相當(dāng)。 27 個(gè)擴(kuò)展的流感 M1 注釋特異性組中的 13 個(gè)攜帶“RS”或“GxY”motif，已知這些motif對于與流感-M158-66 肽/HLA-A*02 的結(jié)合至關(guān)重要。網(wǎng)絡(luò)分析將這些具有相同 CDR3β 序列成員的四聚體注釋的特異性組組織成社區(qū)。屬于給定社區(qū)的特異性組始終用相同的 HLA 四聚體注釋，表明某些抗原特異性組雖然共享不同的序列motif，但表現(xiàn)出相同的特異性和 HLA 限制。在用四聚體注釋的 394 個(gè)共享特異性組中，634 個(gè)相同的 CDR3β 序列成員中有 588 個(gè)（93%）連接了用相同四聚體注釋的特異性組。在用四聚體注釋的 71 個(gè)克隆擴(kuò)展的特異性組中，92 個(gè)相同的 CDR3β 序列成員中的 92 個(gè)（100%）連接了用相同四聚體注釋的組。該結(jié)果表明，雖然 CDR3β 序列不是特異性的唯一決定因素，但在絕大多數(shù)情況下，對 CDR3β 序列的 GLIPH2 分析會導(dǎo)致正確的特異性推斷。
HLA allele enrichment within TCR specificity groups makes robust inferences of HLA restriction
我們接下來檢查了特異性組內(nèi)的 HLA 等位基因富集是否準(zhǔn)確反映了四聚體注釋的 HLA context。分析量化了所有用四聚體 CDR3β 序列注釋的克隆擴(kuò)展特異性組中 HLA 超型的富集。這里專注于 HLA-A*02 和 HLA-B*08 超類型，因?yàn)檫@些四聚體定義的 HLA context在 MDACC 數(shù)據(jù)集中最為豐富。分析推斷，如果給定的特異性組由 HLA/肽四聚體注釋，則 GLIPH2 觀察到屬于同一超型的 HLA 等位基因富集的可能性應(yīng)該更高。事實(shí)上，所有 HLA-A*02 四聚體注釋的特異性組中有 36.7% 富含 HLA-A*02 超型等位基因，而用非 A*02 四聚體注釋的組中沒有一個(gè)被富集。雖然 62.5% 的 HLA-B?08 四聚體注釋的特異性組富含 HLA-B?08 超型等位基因，但只有 3.13% 的非 B?08 四聚體注釋的組被富集。因此，特定組內(nèi)給定 HLA 等位基因的富集準(zhǔn)確反映了同源抗原的 HLA 背景。先前的工作還通過在報(bào)告基因 T 細(xì)胞中表達(dá) TCR 異二聚體并鑒定其肽-MHC 特異性來驗(yàn)證推斷的 HLA restricting element。
Inferred T cell specificities enable robust comparisons of T cell repertoires across patients
使用 GLIPH2 建立 TCR 特異性組的主要優(yōu)勢之一是它極大地促進(jìn)了跨個(gè)體的 TCR 庫分析。 在 MDACC 肺癌數(shù)據(jù)集中，平均約 0.4% 的曲目在任何兩名患者之間共享。 在考慮 4,226 個(gè)共享特異性組（富含克隆擴(kuò)增的 TCR 序列）時(shí)，測量此類共享特異性的可能性增加到 1.9%，在考慮所有 66,094 個(gè)共享特異性組時(shí)增加到 5.3%。 這表明 GLIPH2 捕獲了 T 細(xì)胞庫中的共享特異性，其程度是僅通過比較個(gè)體之間的 CDR3β 序列是不可能的。
接下來，推斷如果在特定疾病背景下存在有限數(shù)量的共享 TCR 特異性，那么在給定足夠多的患者的情況下，特異性組的數(shù)量應(yīng)該達(dá)到飽和。通過從攜帶至少一個(gè)最流行的 HLA-A02:01 等位基因副本的患者中進(jìn)行引導(dǎo)，我們發(fā)現(xiàn)富含 HLA-A02:01 的特異性組的數(shù)量在約 70 名患者時(shí)達(dá)到飽和。需要來自至少九名患者的Repertoires來建立所有特異性組的一半（n = 77）。相比之下，來自 A?02:01 陰性患者的并發(fā)引導(dǎo)占 A?02:01 豐富的特異性組的比例要少得多。此外，來自具有可比 CDR3β 測序深度的獨(dú)立健康隊(duì)列的引導(dǎo)在相似的樣本量下并未達(dá)到飽和，這與攜帶 A*02:01 等位基因的 NSCLC 患者中屬于這些特異性組的 TCR 的患病率較高一致。值得注意的是，建立一半特異性組所需的患者數(shù)量取決于克隆擴(kuò)增的水平、特異性組的數(shù)量和測序深度。因此，可以用有限的患者數(shù)量建立一套完整的 TCR 特異性組。此外，這些結(jié)果表明 HLA 等位基因富集增強(qiáng)了 T 細(xì)胞特異性推斷。
Experimental validation of GLIPH2-inferred specificities
鑒于 T 細(xì)胞特異性的實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證需要 TCRα/β 對，因此對斯坦福大學(xué)治療的 15 名早期 NSCLC 患者進(jìn)行了單細(xì)胞 TCR 測序（scTCR-seq）。從手術(shù)切除的標(biāo)本中制備腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞，并在測序前通過熒光激活細(xì)胞分選 (FACS) 對索引進(jìn)行分選。 scTCR-seq 產(chǎn)生了 4,704 個(gè)配對的 CDR3α 和 CDR3β 序列。將這些 CDR3β 序列與 MDACC NSCLC 序列結(jié)合起來進(jìn)行 GLIPH2 聯(lián)合分析。選擇驗(yàn)證屬于三個(gè)流感 M1 注釋特異性組（SV%SNQP、SIRS%YE 和 S%RSTDT）和一個(gè) EBV BMLF1 注釋特異性組 (RTG%GNT) 的四個(gè) T 細(xì)胞克隆。我們使用同時(shí)缺乏 TCR? 和 TCRβ 的 Jurkat 76 細(xì)胞來表達(dá)四種 TCR 候選物，并將它們與用各自肽脈沖的 HLA-A*02+ T2 細(xì)胞共培養(yǎng)。他們中的三個(gè)在 HLA-A*02 的背景下對他們預(yù)測的抗原做出了反應(yīng)，顯示了 GLIPH2 在推斷 T 細(xì)胞特異性方面的穩(wěn)健性。對結(jié)核分枝桿菌研究中特異性組成員的類似分析發(fā)現(xiàn)，約 80%–90% 的 TCR 識別預(yù)測的肽-MHC 配體。
Characterization of tumor-enriched specificity groups
為了確定與疾病相關(guān)的特異性組，我們重點(diǎn)研究了 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組，這些組與相鄰肺相比，顯示出腫瘤中的強(qiáng)烈克隆偏倚。使用來自 84 名患者（總共 n = 178）的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，我們發(fā)現(xiàn)屬于這些富含腫瘤的特異性組的 T 細(xì)胞的百分比與癌癥進(jìn)展的基因集富集分析 (GSEA) 標(biāo)志性特征相關(guān)，包括 MYC 和細(xì)胞周期程序。相比之下，使用在相鄰肺中擴(kuò)展的特異性組（n = 114），我們未能觀察到與 GSEA 標(biāo)志基因集的任何顯著相關(guān)性。因此，該結(jié)果顯示了 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組與侵襲性、高度增殖性癌癥表型之間的相關(guān)性。接下來，我們系統(tǒng)地檢查了 MDACC 隊(duì)列中 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組中所有 HLA 等位基因的富集情況，并且在大多數(shù)情況下僅發(fā)現(xiàn)了一個(gè)主要等位基因。值得注意的是，我們發(fā)現(xiàn)在motif富含多個(gè)主要等位基因的情況下，例如，同時(shí)富含 HLA-B*07:02 和 HLA-C*07:02 的那些，相關(guān) HLA 等位基因中的強(qiáng)連鎖不平衡可能被觀察。
Identification of a shared specificity group cross-reactive to tumor and pathogen-derived antigens in human lung cancer
在 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組中，我們優(yōu)先考慮滿足以下標(biāo)準(zhǔn)的那些：（1）具有來自斯坦福隊(duì)列的配對 TCRα/β 克隆型和（2）通過 Fisher 精確檢驗(yàn)顯著富含 HLA-A*02 等位基因。 這使我們專注于具有“S%DGMNTE”CDR3β motif的特異性組。 因此，選擇帶有 CDR3α 序列 CAVLMDSNYQLIW 和 CDR3β 序列 CASSGDGMNTEAFF 的候選 TCRα/β 克隆型（稱為 TCR2）用于抗原鑒定.
為了鑒定候選克隆 TCR2 的同源表位，我們在野生型 HLA-A*02:01 的背景下篩選了展示四種不同長度（8-11 個(gè)氨基酸）肽的酵母文庫。使用 TCR2 多聚體進(jìn)行的四輪選擇導(dǎo)致 11 聚體文庫中肽序列（模擬表位）的富集（表 S5）。我們對前 20 個(gè)富集的擬表位進(jìn)行了體外刺激試驗(yàn)，結(jié)果顯示前兩個(gè)序列“AMGGLLTQLAM”和“KLGGLTMVGV”刺激了表達(dá) TCR2 的 Jurkat 細(xì)胞（Jurkat-TCR2）。蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫搜索 (UniParc) 導(dǎo)致鑒定出多個(gè)內(nèi)源性 9 聚體，這些 9 聚體與前兩個(gè)擬表位具有密切的序列相似性，并預(yù)測結(jié)合 HLA-A*02:01，錨定點(diǎn)間隔為 6 個(gè)而不是 8 個(gè)氨基酸.事實(shí)上，頂級模擬表位的 9 聚體變體將 Jurkat-TCR2 細(xì)胞刺激到與 11 聚體對應(yīng)物相當(dāng)?shù)乃?。該結(jié)果表明鑒定的 HLA-A*02 抗原實(shí)際上是 9 聚體。
在功能上驗(yàn)證了所有候選內(nèi)源性肽 9 聚體，類似于前兩個(gè)模擬位（11 聚體）。 我們發(fā)現(xiàn)來自哺乳動(dòng)物蛋白 TMEM161A (TMEM9-mer, ALGGLLTPL) 的 9-mers、來自 EBV 的潛伏膜蛋白 2a (LMP9-mer, CLGGLLTMV) 和來自大腸桿菌的腸桿菌素輸出蛋白 (EntS9-mer, LLGGLLTMV) 可以 都刺激 Jurkat-TCR2 細(xì)胞。 這些結(jié)果表明 TCR2 與來自人類和病原體的抗原發(fā)生交叉反應(yīng)。 HLA 限制的準(zhǔn)確 GLIPH2 推斷促進(jìn)了 HLA-A*02:01 酵母文庫的抗原發(fā)現(xiàn)。
為了表明全長蛋白質(zhì) TMEM161A、LMP2 和 EntS 可以被處理，呈現(xiàn)在 HLA-A*02:01 上，并激活特定的 T 細(xì)胞，在 HLA-A*02+ 293T 細(xì)胞中過表達(dá)這些蛋白質(zhì)并測量了 表達(dá) TCR2 的共培養(yǎng)原代 T 細(xì)胞的反應(yīng)。 與脈沖肽類似，表達(dá)全長 TMEM161A、LMP2 和 EntS 的 293T 細(xì)胞都刺激了共培養(yǎng)的 TCR2-T 細(xì)胞，其中 TMEM161A 似乎是最弱的刺激物。 我們進(jìn)一步進(jìn)行了生物層干涉測量，以量化每個(gè)交叉反應(yīng)表位對 TCR2 的結(jié)合親和力，并表明最弱的刺激物 TMEM9-mer 顯示與 TCR2 的最穩(wěn)定結(jié)合。 因此，該結(jié)果表明結(jié)合親和力和信號強(qiáng)度的部分解耦，類似于之前的報(bào)告。 總之，我們確定了一個(gè)富含腫瘤的 TCR 特異性組，對 TAA 和病原體衍生的抗原具有交叉反應(yīng)性。
TMEM161A is overexpressed on human lung cancer
發(fā)現(xiàn)與鄰近肺組織相比，人肺癌中 TMEM161A 蛋白的表達(dá)水平顯著更高。我們還注意到一些腫瘤切片上 TMEM161A 表達(dá)的一些異質(zhì)性。我們還檢查了癌癥基因組圖譜 (TCGA) NSCLC 數(shù)據(jù)集中的 TMEM161A 基因表達(dá)。與蛋白質(zhì)表達(dá)一致，我們發(fā)現(xiàn)與相鄰肺相比，腫瘤中 TMEM161A 轉(zhuǎn)錄物的水平更高。與腺癌相比，肺鱗狀細(xì)胞癌 (SCC) 中 TMEM161A 的表達(dá)水平更高。斯坦福大學(xué)隊(duì)列樣本的全外顯子組測序未發(fā)現(xiàn) TMEM161A 基因座編碼區(qū)內(nèi)的任何突變，支持其作為非突變 TAA 的作用。同樣，在泛肺癌 TCGA 數(shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn) TMEM161A 基因座中不到 1% 的有害突變 (n = 6/1053)。此外，肺癌中 TMEM161A 的表達(dá)與與細(xì)胞增殖程序和原癌基因 MYC 靶標(biāo)相關(guān)的 GSEA 特征相關(guān)，這與 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組揭示的總體趨勢一致。相比之下，TMEM161A 表達(dá)似乎與炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因組呈負(fù)相關(guān)。這些數(shù)據(jù)表明，TMEM161A 是一種在人類 NSCLC 中過度表達(dá)的 TAA，并與基因表達(dá)特征（如 MYC 和細(xì)胞周期）相關(guān)。
T cells recognizing TMEM161A antigen have the “S%DGMNTE” sequence motif
我們進(jìn)一步query了體內(nèi) TMEM161A 特異性 CD8+ T 細(xì)胞的 TCR 序列身份并檢查了它們的臨床相關(guān)性。可以在 MDACC NSCLC 隊(duì)列中的 31/78 (40%) HLA-A*02+ 患者中檢測到 TMEM161A 特異性 T 細(xì)胞。我們使用 TMEM9-mer/HLA-A*02 四聚體從患者 A6 的腫瘤中分選 T 細(xì)胞，其中 TCR2 克隆首次被鑒定。來自腫瘤和鄰近肺的 TMEM9-mer/A02 四聚體 + T 細(xì)胞的 scTCR-seq 證實(shí)它們攜帶“S%DGMNTE”motif，這與它們在體內(nèi)對 TMEM161A 的識別一致。我們接下來研究了腫瘤特征如何影響 HLA-A02+ 患者中具有“S%DGMNTE”motif的 T 細(xì)胞的募集。我們觀察到，與腺癌相比，在 SCC 中更頻繁地觀察到具有“S%DGMNTE”motif的 T 細(xì)胞，類似于 TMEM161A 的表達(dá)模式。我們還注意到，突變計(jì)數(shù)小于 500 的腫瘤中具有“S%DGMNTE”motif的 T 細(xì)胞百分比高于突變計(jì)數(shù)大于 500 的腫瘤（總 n = 34），盡管這一觀察結(jié)果可能受總浸潤性 T 細(xì)胞數(shù)量和突變負(fù)荷之間的關(guān)聯(lián)的影響。最后，雖然在腫瘤中檢測到的帶有“S%DGMNTE”motif的 T 細(xì)胞并不能預(yù)測患者的預(yù)后，但我們觀察到帶有“S%DGMNTE”CDR3β motif的 T 細(xì)胞屬于 146 個(gè)在沒有復(fù)發(fā)。
CD8+ T cells with the “S%DGMNTE” motif were also detected in healthy donors
為了表征交叉反應(yīng)性 TMEM161A 特異性和病原體特異性克隆型，我們使用 TMEM9-mer/HLA-A*02 四聚體或 EntS9-mer/HLA-A*02 四聚體從 HLA-外周血中分選 CD8+ T 細(xì)胞。 A?02+ 健康供者和 FACS 的 NSCLC 患者。 我們發(fā)現(xiàn)健康供體和肺癌患者中 HLA-A*02/TMEM9-mer+ CD8 T 細(xì)胞的頻率沒有差異，這表明這些 T 細(xì)胞可能由于與病原體衍生抗原的交叉反應(yīng)而得以維持。 與此一致，由四聚體或 GLIPH2 量化的這些特定 T 細(xì)胞的頻率約為每 103–105 個(gè) T 細(xì)胞中的一個(gè)（四聚體測量：0.0032%–0.0980%；GLIPH2 推斷：0%–0.2643%） ，高于人 CD8+ T 細(xì)胞的初始水平。
無論使用哪種四聚體來分選外周血 T 細(xì)胞，分選細(xì)胞的 CDR3β 序列始終帶有“S%DGMNTE”motif。 事實(shí)上，我們發(fā)現(xiàn)了多種 CDR3β 序列共享“S%DGMNTE”motif，其中 % 可能是甘氨酸、谷氨酸或絲氨酸，證實(shí)了使用 MDACC 數(shù)據(jù)在 GLIPH2 分析中看到的多樣性。 此外，單細(xì)胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 數(shù)據(jù)表明 HLA-A*02/TMEM9-mer+ 細(xì)胞主要表現(xiàn)出效應(yīng) T 細(xì)胞狀態(tài)，表明它們以前曾遇到過它們的同源抗原，即使在健康個(gè)體中也是如此。
為了在功能上驗(yàn)證來自四聚體分選克隆的 CDR3α/β 序列，我們生成了穩(wěn)定的 Jurkat 細(xì)胞，表達(dá)了用四聚體鑒定的 TCRα/β 鏈。然后，我們在 HLA-A*02:01 的背景下量化了它們對 TMEM9-mer 和病原體衍生的 9-mers 的反應(yīng)性。我們發(fā)現(xiàn)具有“S%DGMNTE”CDR3β motif的 Jurkat 細(xì)胞克隆只有在與允許的 TCR2α 鏈（CDR3α：CAVLMDSNYQLIW）配對時(shí)才能對所有交叉反應(yīng)肽產(chǎn)生反應(yīng)。例如，我們鑒定了一個(gè) CDR3α/β 對，它不攜帶“S%DGMNTE”motif并識別 TMEM9-mer 但不識別微生物抗原 (TCR16)。最后，我們通過將 HLA-A*02+ 肺癌細(xì)胞系 H1395 與表達(dá) TCR2 的原代 T 細(xì)胞共培養(yǎng)，量化了由交叉反應(yīng)表位誘導(dǎo)的細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性。與無肽對照相比，LMP9-mer 和 TMEM9-mer 均誘導(dǎo)了超過 50% 的靶細(xì)胞裂解。與使用 LMP9-mer 的癌細(xì)胞相比，用 TMEM9-mer 脈沖的癌細(xì)胞是細(xì)胞介導(dǎo)的細(xì)胞毒性較弱的靶標(biāo)，這與 T 細(xì)胞活化研究的結(jié)果一致?？傊?strong>具有“S%DGMNTE”motif的 CD8+ T 細(xì)胞與 TMEM161A 腫瘤抗原和病原體衍生抗原 EntS 和 LMP2 與允許的 α 鏈配對時(shí)發(fā)生交叉反應(yīng)。識別 HLA-A*02 上的這些交叉反應(yīng)抗原導(dǎo)致帶有“S%DGMNTE”motif的 CD8+ T 細(xì)胞裂解靶細(xì)胞。
Phenotypic characterization of TMEM161A-specific CD8+ T cells in lung cancer
我們使用 SMART-seq 方法對來自 10 名 NSCLC 患者的 2,950 個(gè)分選的腫瘤浸潤 T 細(xì)胞的完整單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行了測序，并獲得了它們的配對 CDR3α/β 庫。分析確定了 14 種主要細(xì)胞狀態(tài)，其中 13 種可以映射到單獨(dú)隊(duì)列中報(bào)告的那些狀態(tài)。cluster c5、c6、c12（具有效應(yīng)表型的 CD8+ T 細(xì)胞）、c7 和 c10（具有常駐記憶表型的 CD8+ T 細(xì)胞）是擴(kuò)展最多的。為了揭示特定于共享抗原的克隆的細(xì)胞狀態(tài)，檢查了 TCR 特異性組成員的 scRNA-seq 譜。我們發(fā)現(xiàn) 2.9% 的 T 細(xì)胞 (n = 86/2950) 屬于克隆擴(kuò)增的特異性組。這些 T 細(xì)胞中有 12 個(gè)是 435 個(gè)富含腫瘤的特異性組的成員，而這些 T 細(xì)胞中有 13 個(gè)被推斷為對病毒表位具有特異性。有趣的是，屬于富含腫瘤的特異性組的 T 細(xì)胞偏向于效應(yīng)表型 (c5)，并且差異表達(dá)的 EOMES、KLRG1、GZMK 和其他基因在活化的自然殺傷細(xì)胞中表達(dá)。一致地，來自腫瘤的 HLA-A*02/TMEM9-mer 四聚體分選的 CD8+ T 細(xì)胞也優(yōu)先表現(xiàn)出效應(yīng) T 細(xì)胞表型 c5。偽時(shí)間軌跡和激活/耗竭特征評分表明這些 T 細(xì)胞采用不同的細(xì)胞狀態(tài)。相比之下，推斷為病毒特異性的 T 細(xì)胞表現(xiàn)出的細(xì)胞狀態(tài)包括效應(yīng)子 (c5、c6、c12) 和組織駐留記憶表型 (c7)。總之，TMEM161A 特異性 CD8+ T 細(xì)胞在 NSCLC 中顯示出一系列效應(yīng) T 細(xì)胞狀態(tài)，與原位識別其同源抗原一致。
Expansion of EBV-specific T cell clones in patients responding to immune checkpoint blockade
為了了解病原體特異性 T 細(xì)胞是否可能影響對抗 PD1 檢查點(diǎn)免疫療法的臨床反應(yīng)，我們分析了兩名對治療有臨床反應(yīng)的 NSCLC 患者的 TCR 庫。我們對治療前和治療后的血液樣本中的配對 CDR3α/β 庫進(jìn)行了測序，并鑒定了 102 個(gè)在治療后樣本中擴(kuò)增的 CDR3β 克隆型。在這些擴(kuò)增的克隆中，41 個(gè)屬于在腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞 CDR3β 庫中鑒定的 99 個(gè)特異性組（總 n = 66,094）。我們使用四聚體定義的 T 細(xì)胞 CDR3β 序列來注釋這些特異性組，發(fā)現(xiàn) 11 個(gè)（總共 n = 99）包含 3 個(gè)推斷識別 EBV 和流感抗原的擴(kuò)展 CDR3β 克隆。為了驗(yàn)證特異性推斷，我們創(chuàng)建了兩個(gè)表達(dá) TCRα/β 鏈的 Jurkat 細(xì)胞克隆，推斷可以識別 EBV 抗原，以及一個(gè)表達(dá)野生型 B35 的 T2 細(xì)胞系。事實(shí)上，在與 T2-B35 細(xì)胞共培養(yǎng)后，Jurkat-TCR27 和 -TCR28 細(xì)胞都對預(yù)測的 EBV 肽有反應(yīng)。值得注意的是，這些 EBV 特異性特異性組不僅在治療后得到了擴(kuò)展，而且與相鄰肺相比，還顯示出腫瘤的偏倚，表明對未知 TAA 的潛在交叉反應(yīng)。此外，我們發(fā)現(xiàn)從患者 A11 鑒定的 EBV 特異性克隆 TCR15（CDR3β：CSARGVGNTIYF）被推斷具有與先前報(bào)道的在臨床反應(yīng)時(shí)接受免疫檢查點(diǎn)阻斷的患者中檢測到的兩個(gè)克隆相同的抗原特異性（CDR3β：CSARVGVGNTIYF和 CSARSGVGNTIYF)。我們的分析表明，這些克隆屬于預(yù)測在 HLA-A*02 背景下識別 EBV-BMLF1 (GLCTLVAML) 的“R%GVGNT”特異性組。我們進(jìn)一步測試了來自人類 ORFeome 的三個(gè)相似表位，這些表位被預(yù)測為結(jié)合 HLA-A*02，發(fā)現(xiàn)來自人類 CLDN2 基因座的內(nèi)源性“LLGTLVAML”也刺激了 Jurkat-TCR15 克隆，表明 TCR15 確實(shí)與兩者交叉反應(yīng)EBV 和 TAA。總之，這些結(jié)果表明，患者體內(nèi)的病原體特異性 T 細(xì)胞可能在免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療后的抗腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮作用。
Discussion
雖然最近關(guān)于癌癥中 T 細(xì)胞特異性的工作集中在個(gè)體通常獨(dú)有的新抗原上，但先前的工作也描述了在腫瘤中不適當(dāng)表達(dá)或過度表達(dá)的共享腫瘤抗原。在這里，我們開發(fā)了一種方法來系統(tǒng)地調(diào)查大量 NSCLC 患者的 TCR 庫，以發(fā)現(xiàn)共享的 T 細(xì)胞特異性。使用 GLIPH2 算法，我們首先將原始 TCR 序列數(shù)據(jù)提煉成一個(gè)更小、更有用的共享特異性組集合，并推斷出 HLA 限制。然后，我們將與疾病相關(guān)的 TCR 候選者優(yōu)先考慮用于抗原發(fā)現(xiàn)。酵母文庫的巨大多樣性極大地促進(jìn)了抗原鑒定和交叉反應(yīng)抗原的發(fā)現(xiàn)。與在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中構(gòu)建的其他 MHC/肽庫不同，酵母庫包含近 109 個(gè)隨機(jī)排列的肽序列。雖然以前 HLA 限制的不確定性限制了使用酵母文庫進(jìn)行抗原識別的成功，但我們通過使用 GLIPH2 來推斷候選 TCR 的正確 HLA context克服了這一限制。
在肺癌中使用這種方法，我們發(fā)現(xiàn)了 TCR 與腫瘤和微生物抗原交叉反應(yīng)的例子。因此，這似乎是對病原體特異性 T 細(xì)胞浸潤腫瘤的報(bào)道的可能解釋。我們之前提出，維持廣泛的 T 細(xì)胞庫以抵御病原體可能在很大程度上依賴于 TCR 交叉反應(yīng)性。已在健康個(gè)體的外周血中檢測到自身抗原特異性 T 細(xì)胞，在胸腺中修剪但未克隆性刪除，可能避免病原體的免疫“盲點(diǎn)”。由于癌細(xì)胞過度表達(dá)自身抗原，T 細(xì)胞對自身抗原的特異性可能部分解釋了為什么之前的研究觀察到腫瘤浸潤性 T 細(xì)胞對自體腫瘤的低反應(yīng)性。在這項(xiàng)研究中，我們觀察到，與來自 EBV 和大腸桿菌的抗原相比，TMEM161A 特異性 T 細(xì)胞對自身抗原 TMEM161A 的反應(yīng)相對較弱。盡管反應(yīng)性很弱，但此處提供的數(shù)據(jù)表明，TCR2 與 TMEM9-mer/A*02:01 配體的結(jié)合親和力高于 LMP2 和 EntS。這表明在腫瘤中，TCR 結(jié)合與 T 細(xì)胞活化的解偶聯(lián)可能是另一種機(jī)制，通過該機(jī)制，在腫瘤進(jìn)展過程中抑制了針對 TAA 的特定反應(yīng)的自然過程。這為為什么這些 T 細(xì)胞定位于 TMEM161A 過度表達(dá)但 EBV 和大腸桿菌可能不存在的腫瘤提供了可能的解釋。對此，之前的報(bào)道表明，EBV在肺癌中很少檢出，肺痰中也很少檢出大腸桿菌。
以前，在腫瘤中發(fā)現(xiàn)的常見病原體特異性 T 細(xì)胞被認(rèn)為是“bystanders”，而不是 TAA 特異性的。我們的數(shù)據(jù)顯示 T 細(xì)胞對 TAA 的特異性和病原體來源的抗原并不相互排斥。此外，腫瘤中的這些病原體特異性 T 細(xì)胞表現(xiàn)出效應(yīng)表型，而不是疲憊或壓力狀態(tài)，并且缺乏 CD39 表達(dá)。在這項(xiàng)研究中，我們描述了交叉反應(yīng)性 T 細(xì)胞的例子，與交叉反應(yīng)性微生物抗原相比，它們對共享的非突變腫瘤抗原的反應(yīng)性較弱。盡管反應(yīng)性較弱，但我們的數(shù)據(jù)表明，交叉反應(yīng)性 T 細(xì)胞可能在抗 PD1 檢查點(diǎn)阻斷的情況下在控制癌癥進(jìn)展方面發(fā)揮作用。盡管尚不清楚這些交叉反應(yīng)性 T 細(xì)胞在免疫檢查點(diǎn)阻斷所釋放的抗腫瘤免疫反應(yīng)中起什么作用，但人們很容易推測，接觸交叉反應(yīng)性微生物抗原可能會克服對非突變腫瘤或自身的耐受性-抗原。病原體可以作為免疫療法基礎(chǔ)的想法最初是從威廉·科利的工作中提出的，他在 19 世紀(jì)后期開創(chuàng)了一種名為 Coley 毒素的混合細(xì)菌疫苗，用于治療癌癥患者并取得了一些成功。最近，腸道微生物組已被證明是癌癥免疫治療反應(yīng)的關(guān)鍵決定因素。在胰腺癌中，在術(shù)后存活時(shí)間最長的患者中觀察到了一種獨(dú)特的微生物組組成。識別腫瘤抗原和微生物抗原的交叉反應(yīng)性 T 細(xì)胞也已被證明可以控制小鼠模型中的腫瘤生長。此外，最近顯示 EBV 和流感可誘導(dǎo)針對共享 TAA 的抗腫瘤免疫。需要更多的研究來了解微生物/TAA 交叉反應(yīng)性 T 細(xì)胞與免疫檢查點(diǎn)阻斷的臨床益處之間是否存在因果關(guān)系。
總之，分析提供了一種資源，可以使用可應(yīng)用于任何腫瘤類型的方法來全面表征來自大型 NSCLC 患者隊(duì)列的 TCR。因此，我們將 178 名患者的近 800,000 個(gè) TCR 序列減少到由三個(gè)或更多個(gè)體共享的超過 66,000 個(gè)特異性。在我們確定的 66,000 個(gè)特異性組中，然后我們將它們細(xì)分為 435 個(gè)在腫瘤與相鄰肺中富集的特異性。這個(gè)數(shù)字可能代表的抗原數(shù)量要少得多，因?yàn)榻o定的肽-MHC 配體可以引發(fā)五個(gè)或更多不同的特異性組。我們發(fā)現(xiàn)了非突變的腫瘤抗原和病原體之間有趣的交叉反應(yīng)性，這可以解釋最近描述名義上病毒特異性 T 細(xì)胞浸潤腫瘤的令人費(fèi)解的結(jié)果，這意味著，正如這里提供的其他數(shù)據(jù)一樣，這種交叉反應(yīng)性可能是常見的現(xiàn)象。這增加了對這些致病表位的記憶 T 細(xì)胞可能引發(fā)針對癌癥的交叉反應(yīng)的前景。也許在瘤形成的早期階段，碰巧過度表達(dá)與來自 EBV 的類似抗原發(fā)生交叉反應(yīng)的自身抗原（突變或非突變）的癌前細(xì)胞與這些 T 細(xì)胞相互作用，從而形成慢性、低度炎癥的腫瘤微環(huán)境.為了支持這一點(diǎn)，我們觀察到交叉反應(yīng)性 T 細(xì)胞表達(dá)高水平的顆粒酶 K，這在炎癥性疾病和衰老的背景下已有報(bào)道。由于已知炎癥會促進(jìn)腫瘤形成，因此這可能會促進(jìn)某些細(xì)胞變成惡性的過程。
Method
Classification of TCRs and specificity groups
Annotation of specificity groups
生活很好，有你更好
