1.細胞凋亡的概念
細胞凋亡是細胞的一種基本生物學現象，在多細胞生物去除不需要的或異常的細胞中起著必要的作用。正常的細胞凋亡是在一系列基因的激活、表達以及調控下有序進行的，機體無炎癥反應，且對整個機體的發育是有利和必須的。但腫瘤細胞中，凋亡過程是被抑制的，導致腫瘤細胞無限制地生長、繁殖。通過對多種癌癥的研究表明，MCL-1蛋白的過度堆積，可能是腫瘤細胞細胞凋亡進程被抑制的重要原因。
2.S63845簡介
MCL-1蛋白屬于抑制細胞凋亡的BCL-2分子家族，它存在于眾多腫瘤中。之前從未有過該蛋白的抑制劑被合成，而此次發現的S63845填補了這一項空白。S63845以高親和力特異性結合MCL-1的BH3結合槽，通過激活BAX/BAK依賴性線粒體凋亡途徑，高效地殺死MCL-1依賴性癌細胞，其中包括多發性骨髓瘤，白血病和淋巴瘤細胞。
在發現這一分子后，實驗人員在免疫受損小鼠體內移植了多發性骨髓瘤細胞H929和AMO1，之后靜脈注射S63845，得到的結果令人振奮：S63845在H929模型中最大的腫瘤生長抑制為103%，在AMO1模型中最大的腫瘤生長抑制為114%，并且在AMO1模型中，S63845注射劑量在25 mg/kg時，8只小鼠通過一百天治療有7只小鼠的腫瘤完全消退。
通過進一步的研究表明，這一MCL-1蛋白的抑制劑在單獨或與其他抗癌藥物組合使用時，對一些固態腫瘤細胞系也同樣有效。更加令人驚喜的是：在藥物作用的有效劑量下，正常細胞對S63845完全耐受，未來的病人在合理使用S63845時，很可能不需要忍受副作用的痛苦。因此，S63845小分子的發現，意味著“廣譜抗癌藥物”成為了可能。它或將幫助制藥企業開發出針對多種癌癥的新型藥物。
3.凋亡通路核心分子家族成員介紹
（1）Bcl-2家族
Bcl-2家族最有代表性的家族成員就是Bcl-2分子。Bcl-2分子內含有四個同源結構域，分別是BH1-BH4。家族成員根據分子內所含有的同源結構域的差異，可以分為三個不同的亞家族：
1）Bcl-2亞家族
Bcl2、Bcl-xL、Mcl-1等屬于這個亞家族的成員，幾乎都含有BH1和BH2結構域。Bcl-2亞家族成員對細胞凋亡起到抑制的作用。
2）Bax亞家族
Bax亞家族都含有BH3結構域，但是除了BH3結構域之外，也含有其他的BH結構域。Bax亞家族成員所起到的作用和Bcl-2亞家族成員的功能正好相反，它們起到促進細胞凋亡的作用。包括Bax和Bak。
3）BH3亞家族
這個亞家族內的成員，只含有BH3結構域。它們的作用也是促進細胞凋亡。也稱為凋亡引發亞族（apoptosis initiator group），由僅含BH3結構域的蛋白質組成，包括Bad、Bid、Bim、Puma和Noxa。因為BH3結構域的存在，此類蛋白可以與前兩類Bcl2家族的蛋白互作，從而起到促凋亡的作用。
在Bcl-2家族內，最明星的兩個分子是Bcl-2分子和Bax分子。在沒有凋亡應激的情況下，抑凋亡蛋白Bcl-2或Bcl-xL與促凋亡蛋白Bax或Bak形成異二聚體，抑制Bax/Bad的促凋亡活性，以維持線粒體外膜完整性并阻斷線粒體凋亡。所以細胞內Bcl-2/Bax的比例對決定細胞凋亡的敏感性起到重要作用。當細胞內Bax高表達時，細胞對死亡信號敏感，促進了細胞發生凋亡。當Bcl-2高表達時，Bcl-2可以和Bax形成異源二聚體，抑制細胞凋亡。
在存在凋亡刺激的情況下，促凋亡蛋白Bax表達增加，或者僅含BH3結構域的蛋白（例如Bad，Bid，Bim）的表達增加，隨后它們競爭性結合抑凋亡蛋白Bcl-2以釋放Bax/Bak免受抑制。游離Bax和Bak形成寡聚體，導致細胞色素C通過在線粒體外膜中形成一個通道，從線粒體的膜間空間釋放到細胞質。釋放的細胞色素C激活Caspase級聯反應來誘導細胞凋亡。
如果你觀察kegg圖中線粒體的周邊，Bid蛋白有幾種形式，分別是tBid（truncated Bid ）、gtBid（granzyme B truncated Bid）、jBid（JNK-mediated cleaved Bid），這對應不同來源的Bid蛋白切割產物。下面我們先了解下這3種產物的形成來源。
（1）tBid：Bid可以被Caspase 8切割為截短的產物tBid。全長Bid位于胞質溶膠中時，截短的tBid轉移到線粒體，進一步觸發下游的線粒體凋亡通路。Bid是Caspase 8誘導線粒體損傷的介質，從而將凋亡信號從細胞質膜傳導至線粒體；
（2）gtBid：Bid的另外一種產物gtBid涉及細胞毒性T淋巴細胞（CTLs）對靶細胞的破壞機制。顆粒酶B（granzyme B /GZMB）可以對Bid進行水解切割，以產生轉移到線粒體的截短產物（gtBid）；
（3）jBid：活化的JNK（MAPK通路的重要成員）可以介導Caspase 8非依賴性的Bid切割，產生jBid。jBid會激活與tBid、gtBid不同的下游通路，激活細胞凋亡。
（2）Caspase家族
Caspase家族是一組蛋白酶，介導即將死亡的細胞高效且特異的蛋白水解作用，是細胞凋亡過程中非常重要的效應分子。Caspase蛋白水解酶有三個特征：1）都是半胱氨酸蛋白酶；2）作用位點都在天冬氨酸殘基后的位點；3）Caspase家族成員都是以酶原的形式存在，需要經過活化。
Caspase家族成員，可以按照功能分為三組：
1）凋亡啟動亞類Caspase蛋白酶（apoptoticinitiation）
這一類Caspase包括Caspase-2、8、9和10。它們是細胞凋亡的起始分子。
2）凋亡效應亞類Caspase蛋白酶（apoptoticexecution）
這一類Caspase包括Caspase-3、6和7。它們是具體執行細胞凋亡的效應分子。因此凋亡效應類的Caspase蛋白酶在信號傳導的過程中始終處于凋亡啟動類Caspase蛋白酶的下游。
3）細胞因子激活類Caspase蛋白酶（cytokineactivation）
這一類Caspase包括Caspase-1、4、5和13。這一類Caspase分子與細胞凋亡的關系不是很密切，可能與多種炎癥因子或者細胞因子的成熟有關。
（3）細胞色素C（Cyt C）
細胞色素C在線粒體凋亡過程中處于中心地位。Cyt C是生命體中一種重要的水溶性氧化還原血紅蛋白，由一條肽鏈包裹一個血紅素組成。正常情況下，CytC存在于線粒體內膜上，行使生命體氧化還原反應電子傳遞鏈中的一個環節。細胞凋亡信號的刺激使Cyt C從線粒體內釋放到細胞質，并與細胞凋亡激活因子1（Apaf-1）結合形成凋亡復合體，活化Caspase 9前體，進而激活Caspase 3和Caspase 7，引發Caspase級聯反應，從而誘發細胞凋亡。
（4）P53蛋白
P53大家聽的比較多。P53是一種轉錄因子，可以促進一系列促凋亡基因的表達，因此P53是一個典型的抑癌基因。野生型P53誘導細胞凋亡的途徑包括：
（1）調節細胞周期蛋白。在DNA損傷信號刺激下，P53可以促進p21-Cip1表達，從而抑制CDK2的活性，從而阻止細胞進入DNA合成期，停滯于G1期，進而介導細胞發生凋亡。
（2）通過增加促凋亡蛋白Bax、Bak等的轉錄表達，從而抑制Bcl-2的活性，促進細胞凋亡。
4.介導凋亡的通路
介導凋亡的通路有三條：分別是線粒體通路；內質網通路和死亡受體通路。
（1）線粒體通路
線粒體被認為是處于凋亡調控的中心位置。在線粒體通路中，死亡信號激活含BH3結構域的Bcl-2家族成員，例如Bax。這些含BH3結構域的Bcl-2家族成員（例如Bax）發生寡聚化，并插入線粒體膜，引起線粒體膜通透性改變，跨膜電位丟失，釋放細胞色素C(CytC)和其他蛋白。
CytC的釋放是線粒體凋亡路徑的關鍵限速步驟。CytC與凋亡蛋白酶活化因子(apoptoticprotease-activatingfactor，Apaf-1)形成多聚復合體，通過Apaf-1氨基端的Caspase募集結構域(caspaserecruitmentdomain，CARD)，募集胞質中的Caspase-9前體，并使其自我剪切活化，然后啟動Caspase級聯反應，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成其相應底物的剪切，引起細胞凋亡。
線粒體是細胞能量代謝的中心。細胞凋亡過程中，對線粒體損傷后最直接的結果是線粒體正常功能的喪失。線粒體功能障礙，除了會直接誘導細胞凋亡外，還會導致自由基產生增加、興奮性氨基酸釋放增多、鈣離子超載等現象。如果細胞的損傷程度相對較輕，ATP能提供細胞凋亡所需的能量，則發生細胞凋亡；若細胞的損傷程度較為嚴重，ATP急劇耗竭，則細胞發生壞死現象。
（2）內質網通路
內質網是細胞內蛋白質合成的主要場所，同時也是Ca2+的主要儲存庫。內質網在維持細胞內鈣離子的穩定以及膜蛋白的合成、修飾和折疊等方面都發揮關鍵性作用。當內質網內，鈣離子平衡被破壞或者內質網蛋白的過量積累，都會誘導Caspase-12在內質網膜上的表達，同時內質網也介導了胞質的Caspase-7轉移到內質網表面并激活Caspase-12。激活后的Caspase-12可進一步剪切Caspase-3，引發細胞凋亡。內質網的功能失調在某種程度上可以影響線粒體通路的凋亡現象。許多細胞在凋亡早期，由于內質網中Ca2+的釋放，會導致胞質內Ca2+濃度迅速且持續的升高。高濃度的Ca2+可以激活胞質中的鈣依賴性蛋白酶，又可以作用于線粒體，影響線粒體的通透性并導致線粒體膜電位的改變，從而促進凋亡。
（3）死亡受體通路
胞外的死亡信號可通過死亡受體轉入胞內。死亡受體為一類跨膜蛋白，屬于腫瘤壞死因子受體(TNFR)基因超家族。它們胞外部分都含有一個富含半胱氨酸的區域，胞質區有一個由同源氨基酸殘基構成的結構。這個結構具有蛋白水解功能，被稱為“死亡結構域”(deathdomain，DD)，可使死亡信號得以進一步傳遞，最終啟動凋亡。
已知的死亡受體有五種：1）TNFR-1(又稱CD120a或p55)；2）Fas(又稱為CD95或Apo1)；3）DR3(死亡受體3deathreceptor3，又稱Apo3)；4）DR4（死亡受體4，又被稱為TRAIL-R1）；5）DR5（死亡受體5，又被稱為Apo2，TRAIL-R2)。
與死亡受體相互對應的就是死亡配體（ligand）。與TNFR對應的死亡配體是TNF（腫瘤壞死因子）；和Fas對應的死亡配體是FasL(CD95L)；和DR3對應的死亡配體是Apo-3L(DR3L)；和DR4以及DR5對應的死亡配體是Apo-2L(TRAIL)。
Fas/FasL通路和 TNF/TNFR通路在其中最為重要。
5.凋亡的檢測方法
（1）形態學
光學顯微鏡下細胞縮小、核濃縮、細胞周圍出現透明圈等現象。相差顯微鏡下細胞鼓泡，凋亡小體的產生等現象。透射電鏡觀察到細胞表面微絨毛的消失、核染色質沿核膜分布、新月體形成及凋亡小體的形成等現象。
（2）流式細胞檢測（Annexin V-PI雙染色實驗）
AnnexinV-PI雙染色實驗是用于檢測凋亡的經典實驗方法。
在正常細胞中，磷酯酰絲氨酸只分布在細胞膜的脂質雙分子層的內側。當細胞發生凋亡的早期階段，磷酯酰絲氨酸從細胞膜內側外翻到細胞膜的外側。AnnexinV作為一種磷脂結合蛋白，與磷酯酰絲氨酸有高度親和性。它通過細胞外側暴露的磷酯酰絲氨酸與凋亡早期細胞的細胞膜結合。因此，AnnexinV是檢測細胞早期凋亡的靈敏指標。PI是一種核染料，它不能透過完整的細胞膜。但是在凋亡的晚期階段或者是細胞發生壞死現象，由于細胞膜的完整性已經遭到破壞，使得PI能夠透過細胞膜與細胞核發生結合。因此，通過AnnexinV-PI雙染色實驗，再通過流式細胞儀進行檢測，可以把細胞分為四種類型：
1）AnnexinV陰性且PI陰性（雙陰性細胞），這類細胞是活細胞；
2）AnnexinV陽性且PI陰性，這類細胞是早期凋亡的細胞；
3）AnnexinV陽性且PI陽性（雙陽性細胞），這類細胞是晚期凋亡或者是壞死的細胞；
4）AnnexinV陰性且PI陽性，這種情況可能是由于非特異性染色導致的。因為AnnexinV陰性，表示磷酯酰絲氨酸沒有外翻，說明細胞膜依然具有完整性。PI不能透過完整性的細胞膜和細胞核結合，因此從理論上講，不存在AnnexinV陰性而PI陽性的細胞。
（3）核酸電泳檢測細胞凋亡（DNA片段檢測法）
當細胞發生凋亡時，小分子DNA片段不斷增加，高分子DNA片段不斷減少。凋亡細胞DNA斷裂的特點是DNA斷裂不是隨機的，而是由于內源性的內切酶作用，因此DNA的斷點都是規律性的發生在核小體之間，因此出現的DNA片段都是180-200bp的片段或者是180-200bp整數倍的DNA片段。在凝膠電泳中，如果出現這種特征性的電泳條帶，就可以判斷細胞發生了凋亡。
（4）凋亡明星分子檢測
通常檢測明星分子，采用的是Western Blot的方法檢測蛋白。因此，結合線粒體通路，首先是檢測激活的Cas-9。然后激活的Cas-9再級聯放大激活下游的Cas-3，所以Cas-9和Cas-3幾乎是逃不掉的兩個明星分子。前體分子是Pro-cas-9和Pro-cas-3。在檢測之前，大家需要好好看看抗體的說明書。因為有些抗體只識別前體Cas-9和前體Cas-3，有些抗體即能檢測前體Cas-9和前體Cas-3，又能檢測激活后的Cas-9和Cas-3。
另外，Cas-3激活后可以作用于很多的底物之上，最常檢測的Cas-3的底物是PARP分子。另外，在凋亡發生時，Bcl-2家族成員發揮了重要的作用。例如，抑制凋亡的Bcl-2和促進凋亡的Bax。因此，常常通過western檢測Bcl-2和Bax的表達量，通過Bcl-2/Bax的比值，表征細胞凋亡的程度。對于死亡受體介導的凋亡通路，Fas、FasL、TNF和TNFR，都是常規需要檢測的明星分子。在FasL-Fas通路以及TNF-TNFR通路之下，都涉及到FADD分子。所以檢測FADD也是非常常見的。但是，在TNF-TNFR通路之下，由于這條通路非常地復雜，具體問題具體分析即可。
參考文獻：
[1] Letai A, et al. S63845, an MCL-1 Selective BH3 Mimetic: Another Arrow in Our Quiver. Cancer Cell. 2016 Dec 12;30(6):834-835. ?
[2] Kotschy A, et al. The MCL1 inhibitor S63845 is tolerable and effective in diverse cancer models. Nature. 2016 Oct 27;538(7626):477-482. ? 作者：MCE抑制劑 https://www.bilibili.com/read/cv19069630 出處：bilibili
