本文來自Cancer，DOI: 10.1126/science.aaw9872，喜歡的朋友可以自行下載，不廢話，讀起。

Cysteine depletion induces pancreatic tumor?ferroptosis in mice。

這是一篇介紹腫瘤鐵死亡的文章，高端、大氣、上檔次。不一定能讀懂，但是，我就不想讀懂。鐵死亡是細(xì)胞死亡的一種形式，由脂質(zhì)活性氧(ROS)的災(zāi)難性積累引起。致癌信號(hào)在許多腫瘤類型中增加脂質(zhì)ROS的產(chǎn)生，并被來自氨基酸半胱氨酸的代謝物所抵消。說明了什么，半胱氨酸對(duì)腫瘤鐵死亡具有保護(hù)作用啊。PDAC細(xì)胞使用半胱氨酸合成谷胱甘肽和輔酶A，這兩種物質(zhì)一起下調(diào)鐵死亡。小結(jié)一下：半胱氨酸可以合成GSH和輔酶A，抑制鐵死亡。也就是半胱甘酸可以促進(jìn)腫瘤生長，抑制腫瘤死亡。Cancer的文章，我不能不小心仔細(xì)啊。那么半胱氨酸怎么來的呢，是通過一個(gè)叫Xc-的系統(tǒng)輸入的（我也不懂，一看就高大上）。科普一下，半胱氨酸是非必需氨基酸，可以自己合成的。如何模擬腫瘤在體內(nèi)的環(huán)境呢，轉(zhuǎn)基因鼠是不是要安排一下，發(fā)現(xiàn)敲除Xc-系統(tǒng)中的一個(gè)亞單元SLc7a11就可以誘導(dǎo)腫瘤鐵死亡，當(dāng)然也可以用半胱氨酸（胱氨酸）酶來復(fù)制出同樣的效果。（講的好有道理，我竟然無言以對(duì)）。眾所周知，KRAS突變是胰腺癌最常見的突變形式，突變后的KRAS介導(dǎo)了一系列的生物過程，包括增殖、侵襲、代謝改變等。其中ROS就是KRAS介導(dǎo)諸多生物學(xué)過程所產(chǎn)生的廢物，腫瘤組織如何將其代謝出去避免集聚引起腫瘤氧超載死亡的呢？這里不得不說體內(nèi)的活性氧代謝，一般都是還原成分如GSH將活性氧轉(zhuǎn)化為非活性形式進(jìn)行代謝。

這里是不是可以插入一段什么是活性氧及代謝的簡介啊，安排一下：活性氧（ROS）是含氧的化學(xué)反應(yīng)性化學(xué)物質(zhì)。實(shí)例包括過氧化物，超氧化物，羥基自由基，單線態(tài)氧，和α-氧。在生物學(xué)背景下，ROS形成為氧的正常代謝的天然副產(chǎn)物，并且在細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)和體內(nèi)平衡中具有重要作用。然而，在環(huán)境壓力（例如，紫外線或熱暴露）期間，ROS水平會(huì)急劇增加。這可能會(huì)對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)造成嚴(yán)重?fù)p害，這被稱為氧化應(yīng)激。ROS的產(chǎn)生受植物中應(yīng)激因子反應(yīng)的強(qiáng)烈影響，這些增加ROS產(chǎn)生的因素包括干旱，鹽度，寒冷，營養(yǎng)缺乏，金屬毒性和UV-B輻射。ROS也由外源性源如電離輻射產(chǎn)生。在機(jī)體內(nèi)，ROS的主要來源之一是線粒體內(nèi)膜的呼吸鏈底物端，在線粒體中的電子傳遞鏈復(fù)合物將電子傳遞給O2的過程中，有一部分O2被還原，形成O2-或H2O2。其中，最為重要的是O2-，它是大部分的ROS的前體，主要由線粒體內(nèi)膜呼吸鏈中的蛋白酶復(fù)合體Ⅰ、Ⅲ產(chǎn)生。這部分作為代謝副產(chǎn)物的ROS長期被當(dāng)作損傷生物大分子的毒性分子，但近年來被認(rèn)為在較低水平時(shí)作為一類信號(hào)小分子具有生理作用，另一個(gè)ROS的重要來源是NADPH化酶，其催化亞基被稱為NADPH氧化酶2（NADPHoxidase2，NOX2/gp91phax），能夠在細(xì)胞質(zhì)膜上表達(dá)。在不同的組織中已經(jīng)鑒定了6種NOX-2的同源物：NOX1，NOX3，NOX4，NOX5，DUOX1和DUOX2，統(tǒng)稱為NOX家族蛋白。這些酶能通過質(zhì)傳遞電子產(chǎn)生ROS，可以大量存在于吞噬細(xì)胞，也在其他各種組織細(xì)胞中以較低水平普遍存在，參與很多膜受體下游信號(hào)激活。

正常時(shí)，約2%的氧參與活性氧的產(chǎn)生；生理?xiàng)l件下，適量的活性氧可促進(jìn)免疫、修復(fù)、存活、生長等。消除活性氧的抗氧化體系分為酶系和非酶系，酶系有超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）等，非酶系主要是還原型谷胱甘肽（GSH）、維生素C/E等。細(xì)胞內(nèi)高水平谷胱甘肽GSH，CAT（H2O2酶）、谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）、超氧化物歧化酶SOD、環(huán)孢素、抗凋亡因子Bcl-2，可下調(diào)活性氧的產(chǎn)生水平。以亞鐵血紅素過氧化物酶/辣根過氧化物酶催化H2O2氧化熒光物、產(chǎn)生熒光素的熒光法，特異性和靈敏度較高;通過測定活性氧損傷的產(chǎn)物如脂質(zhì)過氧化物（oxLDL）和DNA損傷產(chǎn)物（8-羥基鳥嘌呤）等，可間接反映活性氧產(chǎn)量。

線粒體是過量的活性氧主要的促調(diào)亡靶，可誘導(dǎo)線粒體雙層膜通透孔（PT孔）開放，釋放鈣離子、細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子AIF，引起胱冬蛋白酶caspase9激活caspase3/6/7；可使線粒體電子傳遞鏈解耦聯(lián)，下調(diào)ATP產(chǎn)生水平，上調(diào)促凋亡蛋白Bax的表達(dá)水平，最后使線粒體外膜破裂，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。活性氧在體內(nèi)作用很廣泛，介導(dǎo)的通路也很多，上個(gè)簡單直觀的圖吧，具體感興趣的朋友可以去檢索一下。

那個(gè)半胱氨酸是怎么進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)的呢，需要Xc-系統(tǒng)（高大上有沒有，有沒有必要科普一下呢？在生理狀態(tài)下Glu/胱氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體（XC-）釋放一分子的Glu，攝取一分子的胱氨酸入細(xì)胞內(nèi)，兩者藕聯(lián)轉(zhuǎn)運(yùn)。胱氨酸在細(xì)胞內(nèi)迅速被還原為半胱氨酸，一部分參與細(xì)胞內(nèi)重要自由基清除劑谷胱甘肽的合成，另一部分則出細(xì)胞氧化成胱氨酸，重新參與XC-系統(tǒng)循環(huán)。生化不學(xué)好，科研都做不了！！就這…………），作者在Xc-譜系缺失小鼠體內(nèi)發(fā)現(xiàn)在正常細(xì)胞中即使Xc-系統(tǒng)缺失，好像對(duì)ROS集聚也沒有太多作用啊，說明正常體內(nèi)對(duì)半胱氨酸需求也不是那么多嗎。那么，腫瘤代謝活躍，產(chǎn)生大量ROS ，對(duì)這個(gè)系統(tǒng)的需求就另說了，可能會(huì)是腫瘤治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)。這個(gè)胱氨酸和半胱氨酸我是徹底蒙了，光是英文就容易錯(cuò)，一個(gè)是cystine（胱氨酸），一個(gè)是cysteine（半胱氨酸），你能知道誰是誰？感覺這個(gè)文章就是講了半胱氨酸在腫瘤體內(nèi)介導(dǎo)了ferroptosis過程，是不是也沒這么難懂了。

首先，要看看半胱氨酸的作用，在培養(yǎng)基里加入不同濃度的胱氨酸或者Xc-系統(tǒng)抑制劑IKE看看效果怎么樣。在五個(gè)PDAC株中的四個(gè)中，胱氨酸饑餓使細(xì)胞存活率降低了80%以上；這在很大程度上可以通過添加親脂性抗氧化劑Trolox來預(yù)防。胱氨酸饑餓的細(xì)胞經(jīng)歷了災(zāi)難性的質(zhì)膜不穩(wěn)定，但是并沒有發(fā)生核碎裂（作者這里有個(gè)視頻）

IKE處理模仿了胱氨酸停用的效果，以一種外觀上與胱氨酸饑餓相同但與星形孢子素誘導(dǎo)的凋亡不同的方式迅速殺死了四個(gè)敏感的PDAC株中的大多數(shù)細(xì)胞（這里作者提供的是視頻）。

處理16小時(shí)后的效果

這里為什么會(huì)用到星狀孢子素（STN）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡我還是不理解。胱氨酸饑餓和系統(tǒng)Xc-抑制(統(tǒng)稱為半胱氨酸耗竭)都不會(huì)誘導(dǎo)caspase3清除（caspase3是經(jīng)典凋亡途徑的標(biāo)記物，還有caspase8、9等，給個(gè)超鏈接，想要學(xué)習(xí)凋亡的老師們可以看看，太復(fù)雜啊，我哭了），說明這種處理后細(xì)胞死亡并不是凋亡，而是一種活性氧超載所致的細(xì)胞死亡，別動(dòng)，回顧一下細(xì)胞死亡類型（凋亡，壞死，鐵死亡，其他未知的死亡方式），這里基本可以排除凋亡、壞死（壞死的時(shí)候細(xì)胞會(huì)腫脹、變大，爆炸），這要不是鐵死亡那作者發(fā)財(cái)了，又發(fā)現(xiàn)了人類未解之迷惑系列，或者可以自己再明個(gè)名什么的，作者要笑醒了。先排除鐵死亡再說吧。

這個(gè)vehicle是DMSO其實(shí)我覺得意思就是個(gè)對(duì)照

作者發(fā)現(xiàn)，去鐵胺(DFO，一種鐵螯合劑)、鐵抑素-1(Fer1，一種鐵死亡抑制劑)或N-乙酰半胱氨酸(NAC，一種半胱氨酸的細(xì)胞通透性類似物)共同處理人PDAC細(xì)胞可以顯著減少半胱氨酸耗竭引起的細(xì)胞死亡，而凋亡或壞死的抑制劑對(duì)細(xì)胞死亡的影響很小。

ZVAD凋亡抑制劑,Nec1s壞死抑制劑,BA1自噬抑制劑

這里感覺凋亡那一塊是個(gè)飛地啊，但是鐵壞死相關(guān)的確實(shí)有作用

可以看出不同細(xì)胞對(duì)自噬的作用還是不一樣的，別動(dòng)，那和鐵死亡、鐵自噬有什么關(guān)聯(lián)？（我覺得可能這個(gè)階段鐵自噬是對(duì)細(xì)胞鐵死亡起到作用的，通過增強(qiáng)鐵自噬促進(jìn)腫瘤死亡）；使用熒光探針C11-BODIPY，我們觀察到半胱氨酸耗竭后細(xì)胞死亡前脂質(zhì)氧化(鐵死亡的一個(gè)標(biāo)志)的大量增加；這可以通過Trolox、Fer-1、NAC和DFO的共同處理來抵消。

綠色是探針標(biāo)記的ROS,紅色是未標(biāo)記的未氧化的脂質(zhì)，別問我什么是PE，我不懂

6-8小時(shí)培養(yǎng)結(jié)果：流式細(xì)胞術(shù)分析Aspc-1細(xì)胞的染色情況(C11-BODIPY是脂質(zhì)氧化的標(biāo)志)，H2-DCFDA是氧化應(yīng)激的標(biāo)志

這個(gè)是應(yīng)激水平的定量分析結(jié)果，沒看到明顯差異啊（每一條表示四個(gè)細(xì)胞系做三次取均值）

上圖B反應(yīng)的應(yīng)該是在胱氨酸饑餓過程中脂質(zhì)過氧化增強(qiáng)了，加入脂質(zhì)過氧化抑制劑Tro可以阻斷這個(gè)過程，但是并沒有改善細(xì)胞的應(yīng)激狀態(tài)。從這些實(shí)驗(yàn)中得出結(jié)論，大多數(shù)PDAC細(xì)胞系依賴半胱氨酸來防止鐵死亡。那么Xc-系統(tǒng)呢？下面是數(shù)據(jù)庫信息挖掘，一波分析走起，對(duì)SLC7A11在人類數(shù)據(jù)集的表達(dá)分析顯示，與正常組織相比，PDAC中有適度的過度表達(dá)，PDAC中過表達(dá)，并且與氧化還原應(yīng)激的特征有關(guān)。

左數(shù)據(jù)庫定量分析結(jié)果，右面用的是META分析，我看不懂，總之是SLC77A11有差異，且是危險(xiǎn)因素。

還是META分析，我不懂。

然后作者又去TCGA上挖數(shù)據(jù)了，我的天，在PDAC上皮和間質(zhì)中表達(dá)存在差異，發(fā)現(xiàn)在多數(shù)腫瘤中SLC7A11也高表達(dá)，而且在部分腫瘤中與低生存相關(guān)。

想要高大上，轉(zhuǎn)基因工程鼠缺不了，而且還是雙重重組基因工程策略（這是什么玩意兒，不懂，就是很高端的感覺）KrasFSF.G12D/+；Tp53R172H/+；Pdx1FlpOtg/+；Slc7a11F1/F1；Rosa26CreERT2/+(KPFSR)小鼠（懂得人來解釋解釋這是什么意思 ）。這個(gè)和自發(fā)成瘤的KPC鼠還是不太一樣，需要條件誘導(dǎo)，是以一種Flpo依賴的方式出現(xiàn)KRAS及TP53突變，誘導(dǎo)胰腺癌自發(fā)發(fā)生的。說是基因型及表型和KPC鼠是一樣的。但是，他莫昔芬通過rosa26位點(diǎn)表達(dá)的Cre重組酶的作用誘導(dǎo)SLc7a11的全身性缺失。這是一種什么神仙設(shè)計(jì)。原來Rosa26中設(shè)計(jì)的是一種條件表達(dá)基因，表達(dá)的是重組酶，重組酶的作用位點(diǎn)是Slc7a11，直接切除了靶基因。excellent。感覺有點(diǎn)畫蛇添足的感覺，為什么不直接把Slc7a11設(shè)計(jì)成條件表達(dá)基因，還有繞一個(gè)彎呢？原因只有一個(gè)，有錢，任性。

最后的表型就是這個(gè)

然后，作者開始又驗(yàn)證了這個(gè)KPFSR鼠的成瘤和重組效率怎么樣了（一臉問號(hào)），我看不懂了，反正很高大上，給你們圖，能看懂的自己看吧。

(A) Representative KPFSR tumor stained with hematoxylin and eosin (H&E).Desmoplastic stroma is stained in pink while nuclei are stained in purple. Scale bar is 50 μm. Arrows indicate malignantepithelial structure (E) versus the stromal component (S). (B) Representative precursor lesions from KPFSR pancreasstained with H&E. Arrows highlight a normal acinus (Ac), acinar-to-ductal metaplasia (ADM),and an early panreaticintraepithelial neoplasia (PanIN). Scale bar is 50 μm. (C) Left panel: Dilution series of mixtures of completelyrecombined DNA to unrecombined DNA, in the indicated ratios. Note preferential detection of recombined allele, withdetection of only a faint unrecombined band in the 4:6 lane. Unrecombined, 1285bp; Recombined, 450bp. Middlepanel: PCR analysis of DNA recombination in tissues (liver, Lvr; spleen, Spln; kidney, Kdny) from SR mice treated withtamoxifen. Right panel: recombination as detected by PCR in KPFSR tumors treated for 6 days with tamoxifen.

我還能讀，我還要讀，朕的江山，朕的子民啊！當(dāng)那個(gè)轉(zhuǎn)基因鼠腫瘤長到4-7mm的時(shí)候，給予6天他莫昔芬和vesicle處理，然后通過超聲觀察腫瘤生長情況。然后就發(fā)現(xiàn)了在KPFSR小鼠已建立的腫瘤中，slc7a11的缺失幾乎是給予vesicle治療的中位生存期的兩倍。在重組組大部分腫瘤呈現(xiàn)出了生長停止或者生長減緩，其中有一例居然消退了，但是vesicle組沒有發(fā)現(xiàn)這種表現(xiàn)。即使補(bǔ)充了半胱氨酸類似物NAC也沒有改變什么。彰顯了Slc7a11的作用。

D圖是實(shí)驗(yàn)開始時(shí)各組腫瘤，腫瘤不僅沒了，還變成負(fù)的了，這是怎么了腫瘤君！！

一只小鼠的腫瘤消退了，看看超聲結(jié)果，我覺得活檢更合適啊。

在尸檢，通過PCR/WB發(fā)現(xiàn)escaped tumor中顯示出 incomplete Slc7a11 recombination，顯示出非重組腫瘤細(xì)胞的生長。

(B) PCR analysis of recombination in endpoint tumors from randomizedsurvival study. Results indicate > 60% recombination of Slc7a11 in endpoint samples (See Fig S6). (C) Western blot ofSlc7a11 in endpoint tumor samples show limited changes in protein levels in control or tamoxifen treated groups.Controls are wildtype (WT) mouse embyronic fibroblasts (MEFs) and knockout (KO) MEFs generated from ourconditional Slc7a11 allele.

Cancer果然不一樣，不行了，我要倒下了，今天到此為止，預(yù)知后事如何，且聽下回分解。歡迎批評(píng)、指正。