前言：
中國科學(xué)家終于成功在“體外”獲得了小鼠的功能性精子！為了達(dá)到這個目的，研究人員巧妙地將小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）誘導(dǎo)分化成功能性的精子（樣）細(xì)胞，借助輔助生殖技術(shù)產(chǎn)生了健康后代。這項(xiàng)工作2016年2月26日凌晨在線發(fā)表于干細(xì)胞權(quán)威雜志Cell Stem Cell 上[1]，為今后治療男性不育的臨床研究搭建了最為簡易而可行的平臺。
文 | 陳蘇仁（中國科學(xué)院動物研究所 助理研究員）
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在體外獲得有受精能力的生殖細(xì)胞一直都是生殖生物學(xué)和生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題和熱點(diǎn)。這項(xiàng)研究所建立的系統(tǒng)，能夠在體外“復(fù)制/模擬”體內(nèi)精子發(fā)生過程，產(chǎn)生功能性精子樣細(xì)胞。先前的一些研究雖然也報道過成功從“干細(xì)胞”誘導(dǎo)分化產(chǎn)生了“生殖細(xì)胞”，但未充分評估獲得的生殖細(xì)胞的功能性。
近年來國際生殖生物學(xué)領(lǐng)域同行共同認(rèn)為“減數(shù)分裂”是體外誘導(dǎo)形成精子樣細(xì)胞的最大障礙，并制定了確定人工獲得精子的功能性的“黃金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。研究人員必須提供減數(shù)分裂特定時期的核DNA含量、染色體數(shù)目和各階段的染色體形態(tài)、精子樣細(xì)胞生產(chǎn)健康后代等有效證據(jù)。目前，達(dá)到所有以上指標(biāo)（特別是完成減數(shù)分裂）仍然是在體外獲得功能性精子的最大考驗(yàn)。
為克服這個壁壘，中國科學(xué)院動物研究所干細(xì)胞與生殖生物學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的周琪院士、趙小陽研究員與南京醫(yī)科大學(xué)生殖醫(yī)學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室的沙家豪教授組成聯(lián)合研究團(tuán)隊(duì)。第一步，將小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）誘導(dǎo)分化成原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（PGCLC）；第二步，研究人員模擬原始生殖細(xì)胞（PGC）體內(nèi)發(fā)育的“自然組織環(huán)境”，即與睪丸細(xì)胞共培養(yǎng)并添加性激素如睪酮等。最終，ESC來源的PGCLC擦除基因印跡，完成減數(shù)分裂，最終產(chǎn)生了功能性精子樣細(xì)胞，具備上述“黃金標(biāo)準(zhǔn)”，借助胞漿內(nèi)單精注射（ICSI）產(chǎn)生健康后代（如下圖）。
今后，研究人員計劃在基礎(chǔ)研究和臨床治療兩方面將這項(xiàng)研究深入下去。一方面，利用這個系統(tǒng)體外研究調(diào)控減數(shù)分裂的分子機(jī)制；另一方面將檢測該系統(tǒng)是否適用于其他動物，特別是靈長類動物。當(dāng)然，這項(xiàng)實(shí)驗(yàn)室工作距離臨床治療還長路漫漫，可能的危險性必須排除，使用胚胎干細(xì)胞的倫理學(xué)問題也需要慎重考量。
輔助生殖技術(shù)能不能解決全部的男性不育問題？
不育癥是當(dāng)今社會中較為常見的一類生殖健康疾病，困擾著全球范圍內(nèi)約15%-20%的育齡夫婦，其中男性因素約占一半。男性不育病因復(fù)雜，許多遺傳與非遺傳因素均可致病，患者臨床多表現(xiàn)為非梗阻性無精子癥和少、弱、畸精子癥。精子的形成是一個復(fù)雜而連續(xù)的生殖細(xì)胞分化過程，它起始于原始生殖細(xì)胞（PGC）的遷移與增殖，經(jīng)歷精原干細(xì)胞（SSC）的自我更新與分化、精母細(xì)胞減數(shù)分裂和精子變態(tài)等重要過程，最終產(chǎn)生“單倍體”功能性精子。
目前，試管嬰兒對于大眾并不陌生，但是借助這項(xiàng)技術(shù)使患有不育癥的男性成功當(dāng)上父親還是有一個前提條件的——必須有“單倍體”精子。如果男性不育癥患者沒有“單倍體”精子，輔助生殖技術(shù)也束手無策?，F(xiàn)實(shí)中，的確有相當(dāng)一部分男性不育癥患者經(jīng)睪丸活檢沒有“單倍體”精子，僅存在早期發(fā)育階段的生殖細(xì)胞，如精原干細(xì)胞，部分精母細(xì)胞等，這些早期生殖細(xì)胞不是“單倍體”，無法直接用于輔助生殖。
從“干細(xì)胞（ESC）”到“原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（PGCLC）”，再到“精子”
最早在2003年，Hans R. Scholer領(lǐng)導(dǎo)的研究組報道了小鼠胚胎干細(xì)胞（ESC）可體外經(jīng)誘導(dǎo)分化產(chǎn)生卵子樣細(xì)胞。這項(xiàng)開創(chuàng)性研究隨即引發(fā)學(xué)術(shù)界的極大關(guān)注，因?yàn)楦杉?xì)胞居然能夠產(chǎn)生生殖細(xì)胞?!十多年后的今天，相關(guān)研究仍面臨一些主要的問題：精子發(fā)生是一個非常復(fù)雜的生理過程，其中僅有某些階段可體外“復(fù)制”。如前所述，很多研究并未證明人工產(chǎn)生的精子究竟是不是“真正的”精子。
可以說，日本科學(xué)家Saitou實(shí)驗(yàn)室在方面做出了很大的貢獻(xiàn)。Saitou實(shí)驗(yàn)室建立了胚胎干細(xì)胞（ESC）和誘導(dǎo)型多能干細(xì)胞（iPS）分化成為原始生殖細(xì)胞樣細(xì)胞（PGCLC）的黃金方法[3,4]。即先將ESC分化成外胚層樣細(xì)胞（EpiLCs），之后在生長因子或聯(lián)合過表達(dá)三種轉(zhuǎn)錄因子Blimp1、Prdm14和Tfap2c[5]下，約30%的EpiLCs誘導(dǎo)成為PGCLC。但是，PGC樣細(xì)胞無法繼續(xù)在體外完成減數(shù)分裂，需移植到青春期前受體小鼠睪丸曲細(xì)精管中，進(jìn)行類“體內(nèi)”精子發(fā)生，產(chǎn)生精子和卵子。使用相似方法，人ESC也可分化產(chǎn)生PGCLC[6]。
周琪、沙家豪、趙小陽團(tuán)隊(duì)的這項(xiàng)研究，ESC來源的PGCLC真正完全在體外完成了減數(shù)分裂，最終產(chǎn)生了功能性精子樣細(xì)胞，借助輔助生殖技術(shù)產(chǎn)生了健康后代。不僅驗(yàn)證了人工產(chǎn)生的精子是“真正的”精子細(xì)胞，而且不借助受體鼠睪丸曲細(xì)精管移植，完全在體外獲得了功能性精子，向ESC到精子的臨床治療又邁出了一步。
能否從不育癥患者睪丸少量樣本直接獲得單倍體精子？
基于胚胎干細(xì)胞存在很大的倫理學(xué)問題，科學(xué)家考慮能否直接通過微創(chuàng)手術(shù)獲得不育病人的一小塊睪丸組織樣本，通過體外培養(yǎng)方法直接獲得單倍體精子呢？一些研究人員已經(jīng)在這方面有所嘗試。
例如2011年[7]日本科學(xué)家Ogawa研究團(tuán)隊(duì)利用出生后幾天的小鼠睪丸組織小塊，置于瓊脂塊上，氣液聯(lián)合體外培養(yǎng)（添加許多生長因子）最終分化出了單倍體精子，經(jīng)輔助生殖技術(shù)也獲得了健康后代。隨后[8] Ogawa研究團(tuán)隊(duì)利用睪丸組織塊培養(yǎng)模型，將精原干細(xì)胞（SSC）也誘導(dǎo)產(chǎn)生單倍體精子，并產(chǎn)生了健康的后代。但該項(xiàng)技術(shù)效率極低，重復(fù)性也存在爭議。
2014年[9]上海交通大學(xué)仁濟(jì)醫(yī)院干細(xì)胞中心的何祖平教授研究團(tuán)隊(duì)報道了隱睪病人（無單倍體精子）睪丸經(jīng)消化并體外培養(yǎng)（添加RA和SCF等生長因子），可獲得單倍體圓形精子，通過圓形精子注射小鼠卵細(xì)胞（因?yàn)槿说膱A形精子注射人卵細(xì)胞不能發(fā)育）顯示受精卵具有一定發(fā)育潛能。但是，如何較為高效、穩(wěn)定地獲得功能性單倍體精子仍需大量的基礎(chǔ)與臨床研究。
參考文獻(xiàn)：
1.Zhou Q, Wang M, Yuan Y, Wang XP, Fu R, Wan HF, Xie MM, Liu MX, Guo XJ, Zheng Y, Feng GH, Shi QH, Zhao XY, Sha JH, Zhou Q. Complete meiosis from embryonic stem cell-derived germ cells in vitro. Cell Stem Cell 2016, Published online: February 25.
全文鏈接：http://www.cell.com/cell-stem-cell/abstract/S1934-5909(16)00018-7
2.Handel MA, Eppig JJ, Schimenti JC. Applying "gold standards" to in-vitro-derived germ cells. Cell 2014, 157(6): 1257-1261.
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6.Irie N, Weinberger L, Tang WW, Kobayashi T, Viukov S, Manor YS, Dietmann S, Hanna JH, Surani, MA. SOX17 is a critical specifier of human primordial germ cell fate. Cell 2015, 160(1-2): 253-268.
7.Sato T, Katagiri K, Gohbara A, Inoue K, Ogonuki N, Ogura A, Kubota Y, Ogawa T. In vitro production of functional sperm in cultured neonatal mouse testes. Nature 2011, 471(7339): 504-507.
8.Sato T, Katagiri K, Yokonishi T, Kubota Y, Inoue K, Ogonuki N, Matoba S, Ogura A, Ogawa T. In vitro production of fertile sperm from murine spermatogonial stem cell lines. Nature communications 2011, 2: 472.
9.Yang S, Ping P, Ma M, Li P, Tian RH, Yang H, Liu Y, Gong YH, Zhang ZZ, Li Z, He ZP. Generation of haploid spermatids with fertilization and development capacity from human spermatogonial stem cells of cryptorchid patients. Stem Cell Reports 2014, 3 (4): 663-675.
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