hello，大家好，今天我們要繼續分享一些單細胞空間在醫學研究中的運用，參考文章在Spatially organized multicellular immune hubs in human colorectal cancer，2021年9月發表與雜志cell，頂級期刊，非常要借鑒價值，用到了非常多之前介紹的方法，包括單細胞技術，DSP空間技術，RNAscope等時下最熱門的生物學技術，也有很多經典的分析方法，我們邊分享，邊給大家總結。

圖片.png

需要注意的分析點

• 基于鄰域中不同細胞的重復共定位的細胞相互作用網絡
• 細胞類型的基因表達程序
• 細胞相互作用網絡
• NMF 對基因程序的從頭識別,轉錄程序的相似性，轉錄程序的共表達
• 免疫細胞與組織腫瘤細胞的定位問題
• 目標細胞生態位（這個強調過很多次了）
• PAGA分析cluster之間的相似性
• 細胞鄰域分析

In brief

Single-cell transcriptomics-based covariation analysis of human colorectal cancer identifies a spatially resolved myeloid-rich inflammatory hub that is shared by mismatch repair-deficient (MMRd) and mismatch repair-proficient (MMRp) tumors and CXCR3-ligand+ multicellular foci distinct for MMRd tumors.

SUMMARY

對癌癥的免疫反應是高度可變的，mismatch repair-deficient (MMRd) 腫瘤比mismatch repair-proficient(MMRp) 腫瘤表現出更多的抗腫瘤免疫力。為了理解控制這些不同反應的規則，轉錄分析了來自 28 個 MMRp 和 34 個 MMRd 個體的結直腸腫瘤和鄰近正常組織的 371,223 個細胞。對 88 個細胞亞群及其 204 個相關基因表達程序的分析揭示了跨腫瘤的廣泛轉錄和空間重塑。為了發現相互作用的惡性細胞和免疫細胞的hub，分析確定了不同細胞類型中的表達程序，這些細胞類型在受影響個體的腫瘤中共變，并使用空間分析來定位協調程序。在腫瘤-管腔界面處發現了一個與組織損傷相關的髓樣細胞吸引hub和腫瘤內富含 MMRd 的免疫hub，激活的 T 細胞與表達 T 細胞與吸引趨化因子的惡性細胞和髓樣細胞一起。通過識別相互作用的細胞程序，揭示了空間組織的免疫惡性細胞網絡的潛在邏輯。

INTRODUCTION

幾乎所有的腫瘤都被免疫細胞浸潤，但不同癌癥和個體腫瘤之間的免疫反應類型及其對腫瘤生長、轉移和死亡的影響差異很大。 相互作用受到調節，并且它們在腫瘤內的空間組織方式仍然知之甚少。
結直腸腫瘤顯示出很大的免疫反應動態范圍，兩種基因不同的亞型之間存在顯著差異：mismatch repair-deficient (MMRd) 結直腸腫瘤具有高突變負荷，通常含有毒性 T 細胞浸潤，并且對免疫檢查點封鎖有 ~50% 的反應率，而mismatch repair-proficient (MMRp) 腫瘤具有低突變負荷并且在很大程度上對免疫療法無反應。
bulk腫瘤或單細胞的轉錄譜已被用于將結直腸癌 (CRC) 分類為亞型，定義它們的細胞組成，并根據受體-配體對的表達推斷細胞類型之間的相互作用網絡。 然而，這些研究集中在離散的細胞cluster上，并沒有捕捉到轉錄程序的全部范圍，這些轉錄程序可以作為cluster內或跨cluster的程序活動的連續梯度存在。 最近，基于成像的研究強調了基于鄰域中不同細胞的重復共定位的細胞相互作用網絡。 然而，這些研究受到預選標記數量的限制，這些標記可以解析關鍵細胞類型，但不能解析其更精細的特征。
在這里，作者開發了一種基于單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 譜的系統方法來發現細胞類型、它們的基礎程序和細胞cluster，并將其應用于研究人類 MMRd 和 MMRp CRC 的區別特征。在免疫細胞、基質細胞和惡性細胞中鑒定了 88 個細胞亞群，以及 204 個相關的基因表達程序。揭示了基于個體腫瘤不同細胞亞群中基因程序活動共變的多細胞相互作用網絡，并對預測的細胞亞群和程序的關鍵分子進行了成像，以在受影響個體的匹配組織中定位這些相互作用網絡。分析發現基質重塑導致 MMRd 腫瘤中產生骨形態發生蛋白 (BMP) 的成纖維細胞減少，以及整個腫瘤中成纖維細胞衍生的干細胞生態位因子的錯誤定位。在原發性 MMRd 和 MMRp 腫瘤的管腔邊緣發現了惡性細胞、單核細胞、成纖維細胞和中性粒細胞的炎癥相互作用網絡，以及 MMRd 特異性免疫活性熱點，包括與活化 T 細胞相鄰的表達趨化因子的惡性和非惡性細胞。研究展示了一條發現多細胞相互作用網絡的途徑，這些網絡是人類癌癥免疫和致瘤過程的基礎。

RESULTS

A comprehensive atlas of cell subsets, programs, and multicellular interaction networks in MMRd and MMRp CRC（MMRd 和 MMRp CRC 中細胞亞群、程序和多細胞相互作用網絡的綜合圖譜 ）

為了發現惡性、免疫和基質細胞如何在 MMRd 和 MMRp CRC 中相互作用，分析了來自 34 個 MMRd 和 28 個 MMRp 個體（另外收集了 2 個個體的lesion）以及鄰近的正常結腸組織的 36 個未治療的原發性腫瘤樣本。 對分離的新鮮組織進行了基于液滴的 scRNA-seq，保留了 371,223 個高質量細胞，包括 168,672 個上皮細胞（非惡性和惡性）、187,094 個免疫細胞和 15,457 個基質細胞。

圖片.png

• 注：MMR status and clinical characteristics of primary untreated individuals with CRC.

  
  
  圖片.png
• 注：(A) Number of cells in immune (T/NK/ILC, B, Plasma, Mast, Myeloid), stromal (Endothelial cells, Pericytes, Fibroblasts, Smooth Muscle cells, Schwann cells), and epithelial (malignant in tumor and non-malignant in normal specimens) compartment per specimen.(B) Number of cells per cluster (left) and fraction of cells from MMRd, MMRp, and normal specimens (right) within each cluster. Each specimen is indicated by a different color shade and separated by a vertical black line.

通過兩步圖聚類方法定義了細胞subset和轉錄程序。首先，將所有細胞分為 7 個主要部分（T/自然殺傷 [NK]/先天淋巴細胞 [ILC]、B、血漿、肥大、髓細胞、基質/內皮細胞和上皮細胞）。其次，在每個分區內，我們使用一致非負矩陣分解（NMF）推導出cluster（prefix“c”）和轉錄程序（具有共變表達的基因組，prefix“p”）。細胞cluster和基因程序彼此獨立編號。 NMF 對程序的從頭識別實現了多項關鍵分析：(1) 同時識別跨多種細胞類型（例如增殖、代謝和免疫程序）共享的程序，特定于細胞類型（例如漿細胞樣樹突細胞 [pDC]程序），和/或以簇內或簇間的連續梯度表示； (2) 盡管存在強烈的個體特異性轉錄狀態，但發現個體間惡性細胞共有的生物學特性； (3) 識別跨多個腫瘤的共變程序，以找到反映細胞相互作用或對共同觸發因素的反應的協調細胞或狀態網絡。

圖片.png

• 注：(B) tSNEs (t-distributed stochastic neighbor embedding) by major cell partitions (left), tissue type (middle), or specimen (right). (C) NMF-based gene programs can be cell type specific (example 1, pS02-Fibro matrix/stem cell niche) or shared (example 2, pTNI03-proliferation; example 3, pEpi30-ISGs).

Remodeling of the immune cell compartment in MMRd and MMRp CRC（免疫細胞compartment的重構 ）

為了了解 CRC 中差異免疫反應的基礎，首先比較了 MMRd 和 MMRp CRC 與正常結腸組織的免疫組成，發現腫瘤和正常組織之間以及 MMRd 和 MMRp 腫瘤之間發生了顯著的重塑。 具體而言，作為腫瘤（MMRd 或 MMRp）和正常結腸組織之間所有免疫細胞的一部分，43 個免疫細胞cluster中有 37 個differentially abundant。 腫瘤耗盡了產生免疫球蛋白 A (IgA) 的漿細胞、B 細胞、IL7R+ T 細胞和 gd 樣 T 細胞，并富含調節性 T 細胞 (Treg)、單核細胞、巨噬細胞和相對于正常結腸可能的中性粒細胞

圖片.png

• 注：Compositional changes in immune cell clusters in MMRpandMMRd tumors relative to adjacent normal tissue. Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 for MMRp versus MMRd are marked with asterisks.

圖片.png

• 注：(A) Heatmaps showing selected unbiased and well-established marker genes for immune clusters as mean expression in normalized log2(TP10K+1). Clusters with differences in frequency between MMRp and MMRd tumors with Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 are marked with *. A comprehensive list of DEGs for each cluster can be found in Table S2. (B) Changes in immune cell clusters in MMRp and MMRd tumors relative to adjacent normal tissue, showing frequency of immune cells (dot size) and enrichment/depletion (Pearson residual, colored squares). Clusters with differences in frequency between MMRp and MMRd tumors with Kruskal-Wallis false discovery rate (FDR) < 0.05 are marked with *.

腫瘤中單核細胞/巨噬細胞顯著擴增。 單核細胞和巨噬細胞上調腫瘤特異性 NMF 衍生的轉錄程序，其特征在于可以放大炎癥的基因（pM02 中的 MMP12 和 MMP9）、募集骨髓細胞（pM10 中的趨化因子 CCL2 和 CCL7）、刺激生長（pM14 中的生長因子 VEGFA 和 EREG ），并解決炎癥（APOEin pM06）。 來自 MMRd 腫瘤的骨髓細胞顯示出更高的糖酵解基因程序活性 (pM03)、免疫激活警報蛋白如 S100A8/9/12 (pM16) 和吸引單核細胞和中性粒細胞的趨化因子 (pM20)。 總體而言，單核細胞和巨噬細胞在腫瘤中進行了重塑，并在 MMRd 腫瘤中表達了更多的免疫激活程序。

圖片.png

• 注：(B) tSNEs of myeloid cells in all normal and tumor samples. (C) Activities of selected myeloid gene programs with high activities in monocytes and macrophages. Each dot indicates the 75th percentile of the program activity in the myeloid cells of one specimen. GLME (generalized linear mixed model) FDR: **** %0.0001, *** %0.001, ** %0.01, * %0.05, not significant (ns) for > 0.05. tSNEs below show program activities within the myeloid compartment. For each program, the top genes are listed below, with circle size indicating the relative weight of each gene within the program.

T cell compartment differences between MMRd and MMRp tumors

MMRd 與 MMRp 腫瘤的免疫組成的主要變化發生在 T 細胞compartment中。 在 MMRd 腫瘤中富集的cluster中有 CXCL13+ T 細胞和 PDCD1+ gd 樣 T 細胞，而 IL17+ T 細胞在 MMRp 腫瘤中富集。 T 細胞中的 CXCL13 在其他 CRC 和黑色素瘤單細胞研究中已被注意到，并且最近已成為人類腫瘤反應性 CD8+ T 細胞和免疫治療反應的標志物。因此，假設抗腫瘤 T 細胞免疫可能在 MMRd 中經常發生，但在 MMRp 腫瘤中很少發生.

富含 MMRd 與 MMRp T 細胞的程序包括兩個程序（pTNI18 與 CXCL13、PDCD1、TOX；pTNI06 與主要組織相容性復合體 [MHC] II 類、IFNG 和 LAG3）在 T 細胞受體 [TCR] αβ- 和 TCR γσ- 樣 T 細胞中具有高和中等活性細胞，以及 CD8+、γσ-樣、PLZF+ (ZBTB16) T 細胞和 NK 細胞共享的一種細胞毒性程序 (pTNI16)。 PLZF+ T 細胞和 NK/ILC3 細胞被先天 T 細胞程序 (pTNI08) 選擇性標記，與正常組織相比，該程序在 MMRd 和 MMRp 腫瘤中減少。 在三個外部 CRC 隊列中證實了 CXCL13 和細胞毒性程序（僅可歸因于 T/NK/ILC 分區，使我們能夠分析大量數據）的更高 MMRd 活性。 因此，在 MMRd 腫瘤中，T 和 NK 細胞亞群獲得細胞溶解特性（GNLY、GZMB 和 PRF1），并且 T 細胞獲得與慢性刺激相關的耗竭標志物（例如，PDCD1、TOX、LAG3 和 HAVCR2）。

圖片.png

圖片.png

CXCL13+ T cells localize within MMRd tumors

鑒于 CXCL13+ T 細胞在 MMRd 腫瘤中的富集及其先前與免疫治療反應的關聯以及肺癌中三級淋巴結構 (TLS) 的定位，用靶向 CXCL13 和 CD3E 的 RNA 探針對隊列中的組織切片進行了染色。 在整個 MMRd 腫瘤中發現了豐富的 CXCL13+ T 細胞，TLS 之外，通常在侵襲性邊界處發現。 TLS 相關的 CXCL13 主要存在于網狀模式的非 T（CD3E 陰性）細胞中，這與基質和濾泡樹突細胞作為 TLS 中 CXCL13 來源的報道一致。 表達 CXCL13 的常規 CD4+ 和 CD8+ T 細胞位于淋巴結構之外，但靠近癌細胞，與effector activity一致。

圖片.png

• 注：Localization of CXCL13+ T cells in tumor center versus lymphoid structure. Left: H&E. Right: CD3E and CXCL13 RNA in situ hybridization (ISH). Scalebar, 200 mm.

Highly altered endothelial cells in MMRd and MMRp tumors

基質compartment在兩種腫瘤類型中都被重塑，內皮細胞和周細胞作為基質細胞的一部分增加，而淋巴管內皮細胞作為腫瘤內皮細胞與正常細胞的一部分相比減少。除了腫瘤和正常細胞之間共享的一個cluster外，還發現了 8 個腫瘤特異性內皮細胞cluster，在MMRd 和 MMRp 腫瘤之間沒有顯著差異。量化腫瘤內皮細胞cluster與正常結腸細胞之間的相似性（使用基于分區的圖形抽象 [PAGA]），發現了動脈和靜脈細胞的改變版本以及幾個未映射回正常細胞的cluster，例如尖端細胞和增殖細胞。有趣的是，這些增殖的內皮細胞表達 HIF1A 和 CSF3，表明存在代謝和炎癥變化。具有基底膜膠原蛋白、促血管生成分子和尖端細胞標記物的 pS10 程序在所有腫瘤特異性cluster中上調，而干擾素刺激基因 (ISG)/抗原呈遞 (pS05) 程序被抑制，如前所述。因此，內皮細胞在腫瘤中高度改變，具有更多的血管生成程序活性和免疫相關基因表達的變化。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

Inflammatory fibroblasts localize to the luminal surface of tumors

成纖維細胞分為 11 個subgroup，其中 6 個在腫瘤中占優勢，5 個在正常結腸樣本中。 與之前描述的肌成纖維細胞癌癥相關成纖維細胞類似，3 個癌癥相關成纖維細胞亞群 (cS26-cS28)（和腫瘤周細胞）表達了一種收縮程序（pS03），其中包括平滑肌肌動蛋白（ACTA2），其中一個亞群（cS26，肌成纖維細胞）與平滑肌程序（pS01）一起高度表達，與平滑肌細胞和周細胞共享。

圖片.png

• 注：Selected programs in fibroblast and pericyte subtypes shown as in (D). Shown below are PAGA-based connectivity weights > 0.25.

  
  
  圖片.png
• 注Activities of pS03 (ACTA2), pS13 (inflammation), and pS17 (BMP fibro) in fibroblasts and pS03 and pS13 in pericytes, shown as in (E)。

兩個癌癥相關成纖維細胞 (CAF) 亞群（cS28 和 cS29）在兩種腫瘤類型中都表達了炎癥程序 (pS13)，在 MMRd 腫瘤中具有更高的活性。 該程序反映了之前描述的炎癥性 CAF 和炎癥性腸病中的炎癥性成纖維細胞，包括組織重塑因子（MMP1 和 MMP3）和中性粒細胞吸引趨化因子（CXCL8 和 CXCL1）。 8 個 CRC 標本（4 個 MMRd 和 4 個 MMRp）中 MMP3 和無處不在的成纖維細胞標志物 COL1A1 的組織染色顯示，這些高度炎癥的成纖維細胞在 MMRd 和 MMRp 腫瘤的結腸腔邊緣（LM）擴張血管周圍顯著富集。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

BMP-expressing CAFs are reduced in MMRd CRC, whereas CAF-derived stem cell niche factors are abnormally present throughout tumors

為了進一步了解 CAF 的功能改變，基于共享程序和基于 PAGA 的cluster之間的相似性，將 CAF 與來自正常結腸組織的成纖維細胞進行了比較 。鑒定了表達 BMP 的成纖維細胞 (c23、c24) 的 CAF 等效物 (cS27)，這些細胞排列在正常結腸上皮細胞中，并通過 BMP 和 Wnt 拮抗劑（如 FRZB）抑制 Wnt 來驅動上皮細胞分化。 這些可能對應于小腸中 PDGFRA 高的端細胞亞群。 通過 CXCL14 表達將表達 BMP 的 CAF 與其他 CAF subset區分開來。CXCL14+ 成纖維細胞排列在正常組織和腫瘤的上皮細胞中。先前的bulk RNA-seq 研究報告了 MMRd 與 MMRp CRC 中 CXCL14 的表達降低，但表明這是由于惡性上皮細胞中的差異表達。 盡管 MMRd 與 MMRp 惡性細胞中的 CXCL14 表達顯著但適度（減少 ~1.25 倍），但 CXCL14 在惡性細胞中很少表達（~9.2% 的 MMRp 和 1.5% 的 MMRd 惡性細胞），只有一個例外（ MMRp個體C103）。

圖片.png

圖片.png

• 注：(J) Quantification of CXCL14+, GREM1+, and MMP3+ CAFs among COL1A1/COL1A2+ fibroblasts based on whole-slide scans of 5 MMRd and 4 MMRp CRC specimens from (I); Mann-Whitney-Wilcoxon test. Rightmost graph: MMP3+ cells among all COL1A1/COL1A2+ cells outside or inside of the LM (defined as % 360 mm from the luminal border of the tumor); Wilcoxon matched-pairs signed rank test. Only 8 samples are included on the right because one clinical paraffin block did not contain LM. (K) Gene signature scores of top differentially expressed genes from CXCL14+ CAFs, GREM1+ CAFs, MMP3+ CAFs, and all fibroblasts in bulk RNA-seq from TCGA-CRC (COADREAD). Mann-Whitney-Wilcoxon test: ****p %0.0001, ***p %0.001, **p %0.01, *p %0.05, ns for > 0.05.

CAF 還有助于干細胞生態位因子的表達，例如 RSPO3 和 GREM1，它們在整個腫瘤中廣泛表達，而它們在正常組織中的隱窩相關表達較低。 具體而言，在非腫瘤組織中，RSPO3 和 GREM1 的表達受到嚴格限制到隱窩底部以下的區域，最突出的是沿著類似于粘膜肌層的分布。相比之下，GREM1+ 和 RSPO3+ 細胞出現在從基底向上延伸到腫瘤體的基質帶中。在 MMRd 標本中，這些細胞也占據與表達 CXCL14+ BMP 的成纖維細胞的上皮細胞相似的位置。 RSPO3 的高表達可驅動腫瘤生長，并且可能由一小部分人 CRC 中的 PTPRK-RSPO3 融合事件引起。分析的數據表明，增加獲得干細胞生態位因子（如 RSPO3）的更常見機制可能是通過基質細胞和/或其程序（尤其是 CAF）的空間重新分布發生的。

圖片.png

Malignant cells are actively engaged in the immune response

由于惡性細胞通常按個體分組（與按細胞亞群聚集的正常上皮細胞相反），識別它們的共同特性可能更具挑戰性。 因此，我們推導出并分析了惡性細胞中 43 個表達程序的活動，這些程序并非特定于單個個體。 我們還根據與正常結腸上皮細胞亞型的相似性對惡性細胞進行了分類，以更好地了解它們的功能特性。
許多程序在惡性和正常上皮細胞之間具有不同的活性。 例如，與正常上皮細胞相比，惡性上皮細胞的成熟腸上皮細胞程序減少，增殖程序增加，這與絕大多數惡性細胞被歸類為干/轉運擴增 (TA) 樣細胞一致。 在差異活躍的程序中，與 MMRp 相比，有 10 個在 MMRd 中的活性更高，6 個更低，在 3 個外部數據集中驗證了這一發現，以及我們的隊列和癌癥基因組圖譜 (TCGA) 中的類似程序分組。
特別是，3 個免疫相關程序顯示 MMRd 和 MMRp 惡性細胞之間的活性升高：ISG（包括干擾素 γ targets）和 MHC II 類基因程序（pEpi34）在 MMRd 中比 MMRp 腫瘤更活躍（3.4 倍），ISG （I 型干擾素靶點）和 MHC I 類基因程序（pEpi30）在 MMRd 與 MMRp 相比輕度升高（1.6 倍，在正常上皮細胞中也有一些活性），以及中性粒細胞和免疫吸引趨化因子程序（CXCL1、CXCL2 、CXCL3 和 CCL20) (pEpi06) 在 MMRd 與 MMRp 腫瘤（1.6 倍）和兩種腫瘤類型中均高于正常細胞。 因此，惡性細胞，尤其是在 MMRd 腫瘤中，表達可能介導與免疫系統相互作用的免疫相關程序。

圖片.png

圖片.png

圖片.png

圖片.png

Co-variation of program activities across individuals predicts multicellular immune hubs

接下來假設一種細胞類型中基因程序的一些變化可能與另一種細胞類型的變化有關，要么是因為一種細胞類型對另一種細胞類型的直接影響，要么是因為共同影響兩種細胞類型的共享信號或鄰域
為了找到這樣的多細胞協調程序網絡，搜索了與受影響個體樣本相關的程序活動（以下稱為共變程序），分別分析 MMRd 和 MMRp 以更好地捕捉兩種免疫學不同的腫瘤類型之間的差異。 使用 22 個髓系、21 個 T/NK/ILC 細胞基因程序和 MMRd 或 MMRp 衍生的惡性上皮程序（pEpiTd 和 pEpiTp）計算了每組樣本中程序活動的成對相關性。 不包括基質細胞，因為每個樣品的基質細胞數量不足以進行共變分析。 最后，我們使用基于圖的程序聚類來識別 MMRd 中的 7 個共變多細胞hubs和 MMRp 樣本中的 9 個。 這些hubs由跨細胞類型表達的多個程序組成，揭示了多細胞相互作用網絡
為了識別彼此相似的程序，因此更有可能由共同機制觸發，計算了程序之間top基因的重疊。 該分析揭示了不同細胞類型的免疫、代謝和其他程序相似。 分析注意到共變程序不需要彼此相似（盡管它們可以）并且通常以不同的top基因集為特征。
為了研究惡性細胞和免疫細胞之間的相互作用，我們關注了 2 個 MMRd 衍生的多細胞hubs（hubs 3 和 6），其中在免疫細胞中活躍的程序與在惡性細胞中活躍的免疫相關程序共變。

圖片.png

圖片.png

Malignant cells, fibroblasts, monocytes, and neutrophils engage in inflammatory responses at the luminal surface of primary MMRd and MMRp tumors（惡性細胞、成纖維細胞、單核細胞和中性粒細胞在原發性 MMRd 和 MMRp 腫瘤的管腔表面參與炎癥反應 ）

Hub 3 的特點是惡性細胞和單核細胞中的炎癥程序與中性粒細胞程序共變，與正常組織相比，所有這些程序在 MMRd 和 MMRp 腫瘤中都高度活躍。 在hub也發現了 Treg 和 IL17 T 細胞程序。 Hub 3 在 MMRp 樣本中很活躍，它的程序及其相關性在外部單細胞隊列中被概括。 基于炎性骨髓、間質和惡性程序的相似性，顯示重疊基因和共享轉錄因子預測，如核因子 kB (NF-κB) 和 CEPBP，還包括間質程序 pS13（在 GREM1+ 和 MMP3+ CAF 中活躍) 在我們對hub 3 的分析中。
為了了解驅動這些惡性/免疫/基質細胞相互作用的通訊途徑，檢查了在炎癥和共變中性粒細胞程序的top基因中發現的所有趨化因子和細胞因子。 該分析表明，惡性細胞、GREM1+ 和 MMP3+ CAF、單核細胞和表達同源趨化因子 (CXCL1/2/3/5/6/8) 的中性粒細胞協同吸引 CXCR1/2+ 中性粒細胞。 在體外用hub 3 炎癥單核細胞和中性粒細胞程序中發現的細胞因子刺激時，CRC 衍生的成纖維細胞和 CRC 惡性細胞中相同的趨化因子，如 IL1B。因此，惡性細胞、CAF、單核細胞和中性粒細胞似乎協同工作募集骨髓細胞并通過炎性細胞因子放大骨髓細胞的募集。
為了在腫瘤組織中定位這個炎癥hub，對 MMRd 和 MMRp 標本進行染色，以獲得中性粒細胞、骨髓細胞和惡性上皮細胞的標志物以及 IL1B 和 CXCL1 轉錄物。 8 個檢查的樣本中有 7 個顯示在惡性細胞與結腸腔的界面處，尤其是在大量壞死的部位，中性粒細胞以及 IL1B+ 和 CXCL1+ 細胞顯著積聚。盡管在惡性細胞和骨髓細胞中觀察到了 CXCL1，但在既不是骨髓細胞也不是上皮細胞的細胞中存在強烈的 CXCL1 信號。盡管這些細胞很可能是 MMP3+ CAF，因為它們通過 scRNA-seq 表達最高水平的 CXCL1，并且主要在管腔表面發現，但需要進一步的成像研究來證實這一預測。鑒于該炎癥hub的細胞和分子定位以及管腔邊界處的基質重塑，分析認為原發性 CRC 管腔邊緣的損傷可能有助于正炎癥反饋回路，從而驅動富含髓細胞和中性粒細胞的環境在這些腫瘤中。

圖片.png

圖片.png

A coordinated network of CXCL13+ T cells with myeloid and malignant cells（坐標網絡）

Hub 6 由在髓細胞和惡性細胞中表達的 ISG/MHC II 類基因程序組成（可能由干擾素 g[IFNg] 誘導并由 IRF/STAT 轉錄因子驅動），其與 IFNG/MHC-II 和 CXCL13/ PDCD1 T 細胞程序。 這些 T 細胞程序包括激活和耗竭的標志物，已知這些標志物可以標記慢性刺激的腫瘤反應性 T 細胞。
重要的是，當將網絡投影到 MMRp 特定分析中時，沒有在特定于 MMRp 的分析中推導出這個hub，并觀察到核心程序的活動較弱，并且網絡的連接性降低（例如，惡性 pEpiTd19 和 T 細胞 pTNI18 程序之間的聯系丟失） 數據集中的 MMRp 腫瘤和外部 scRNA-seq 數據集，與 MMRp 腫瘤較弱的免疫原性一致 。
為了驗證 ISG/MHC-II 惡性和 CXCL13 T 細胞程序的協同活性，對來自 3 個腫瘤的組織切片進行了空間索引轉錄分析（GeoMx 數字空間分析，DSP），這些腫瘤在匹配 scRNA-seq 中顯示出高 CXCL13 T 細胞程序活性。 我們分析了每個腫瘤切片的 45 個感興趣區域 (ROI)，并進一步將每個區域劃分為上皮和非上皮區域。 我們觀察到每個腫瘤所有區域的惡性上皮區域的 ISG 表達與相鄰非上皮區域的 CXCL13 表達之間呈正相關，進一步支持該hub惡性和 T 細胞之間的潛在相互作用。
除了由衰竭的 T 細胞表達的抑制性受體外，惡性 ISG/MHC-II 程序還具有抑制性分子，包括編碼酶 IDO1 和 CD38 的轉錄物。 IDO1 和 CD38 在 4 個個體的惡性 ROI 中的表達與通過 scRNA-seq 測量的相同個體的表達相當。 此外，IDO1 或 CD38 表達與這兩個基因的高 scRNA-seq 衍生表達和 CXCL13 T 細胞程序的個體的 ISG 評分在空間上相關。 這些結果表明，負反饋是中樞功能的一部分，并受每個腫瘤中患者特異性和區域特異性因素的調節。

圖片.png

圖片.png

CXCL13+ T cells are localized within foci of CXCL10/CXCL11-expressing cells throughout the tumor

鑒于非惡性區域中具有 CXCL13 的惡性細胞中 ISG 的空間相關表達，我們假設 T 細胞將在空間上組織在表達 T 細胞吸引趨化因子的細胞周圍。 我們檢查了 hub 6 基因程序中的所有趨化因子，發現髓系、惡性和間質 ISG 程序包括趨化因子 CXCL9、CXCL10 和 CXCL11，并且它們的同源受體 CXCR3 在活化的 T 細胞和某些樹突狀細胞 (DC) 亞群中上調 .使用我們的三個高度 T 細胞浸潤樣本（個體 C107、C110 和 C132）的空間索引轉錄組學數據集，我們通過發現非上皮細胞中的 CXCL13 表達與相同 ROI 的惡性細胞中的 CXCR3 配體表達相關聯來驗證這一觀察結果。
為了在單細胞分辨率下進一步驗證這種空間關聯，我們對來自 scRNA-seq 隊列的 9 個 CRC 標本進行了全切片染色。 我們發現 CXCL10/CXCL11 陽性細胞聚集成大病灶，富含表達 CXCL13 和/或 IFNG 的細胞以及 CD3E+ T 細胞。 有趣的是，具有高（3 MMRd 和 1 MMRp）與低（2 MMRd 和 3 MMRp）CXCL13+ T 細胞程序活性的標本中的病灶傾向于分別在惡性細胞和非上皮細胞中顯示 CXCL10/CXCL11 表達，但需要額外的研究確認這個觀察 。
在所有樣本中，與 CXCL10/CXCL11 陰性對應物相比，CXCL10/CXCL11+ 惡性細胞平均更接近 CD3E+、CXCL13+ 和 IFNG+ 細胞，并且這些距離在病灶內特別小。 最后，pTNI18（CXCL13 程序）和 pEpiTd19（ISG 程序）具有更高 scRNA-seq 活性的樣本有更多細胞參與 CXCL10/CXCL11 病灶。 因此，我們的研究結果揭示了激活的 IFNG+ 和 CXCL13+ T 細胞以及 CXCL10/CXCL11+ 骨髓和惡性細胞的空間組織病灶，提供了一個正反饋回路的證據——T 細胞衍生的 IFNγ 誘導 CXCR3 配體的表達以吸引更多的 T 細胞——可能是對于在腫瘤內形成這些免疫細胞熱點至關重要。

圖片.png

DISCUSSION

腫瘤是異質的，但腫瘤內的免疫細胞可塑性較差，表現出的行為也更為有限。 在這里，我們確定了重復的、空間組織的細胞-細胞相互作用，這些相互作用有助于 MMRd 和 MMRp 腫瘤中協調的多細胞免疫反應。
這里的研究表明，T 細胞組織在人類腫瘤內的結構化細胞鄰域中。 hubs的形成可能取決于正反饋回路，其中 T 細胞表達的 IFNG 驅動 CXCR3 趨化因子（作為 ISG 反應的一部分）的誘導，然后吸引更多的 T 細胞和其他細胞。 最近的研究表明，在小鼠檢查點抑制劑治療后，誘導抗腫瘤 T 細胞反應需要骨髓細胞中 CXCR3 趨化因子的表達來支持這一觀點。 此外，幾項研究已將 CXCR3 趨化因子系統與 T 細胞進入組織聯系起來，包括黑色素瘤中的 CD8+ T 細胞募集、病毒感染和疫苗接種，其中局部 CXCL9 和 CXCL10 給藥將活化的 T 細胞募集到上皮組織中，即使沒有抗原。在human樣本中，與我們在 hub 6 程序中觀察到的基因重疊的 IFNγ 誘導特征與多種人類腫瘤類型中對 PD-1 阻斷的有利反應相關。 此外，最近對 7 種腫瘤類型（包括 CRC）的meta-analysis發現，克隆性 TMB 和 CXCL9/CXCL13 表達是檢查點抑制劑反應的最強預測因子。 與正反饋回路相反，腫瘤中持續的 ISG hub可能會驅動免疫抑制，因為負反饋會上調共抑制因子，如 PD1/PDL1、Lag3/MHC-II、Tim3/LGALS9 和 IDO1。 事實上，B16 黑色素瘤小鼠模型中的機械工作表明 IFNg 可以驅動多基因抗性程序。 正反饋還是負反饋在特定位置或時間占主導地位對于確定跨腫瘤和治療很重要。
另一個重要問題是這些多細胞免疫形成是否與先前觀察到的組織結構相似。 TLSs 通常位于腫瘤浸潤邊緣以下，含有hub B 細胞，并且與高 T 細胞活性、良好的預后和對免疫治療的有效反應有關。相比之下，hub 6 被發現在腫瘤hub并且沒有生發hub，并且相對于正常結腸，腫瘤耗盡了 B 細胞。一些研究觀察到不太可能是 TLS 的聚合。在黑色素瘤免疫的早期研究中，IFNg、T 細胞和 PD-L1 的染色顯示它們在腫瘤中的空間接近性。另一組觀察到干細胞樣 CD8+ T 細胞與 MHC II+ 類細胞的聚集，這與受影響個體中進展較慢的腎癌有關。第三項研究表明，小鼠接種疫苗誘導了表達 CXCL10 的 T 細胞和骨髓細胞的 IFNg/CXCR3 依賴性空間hub。這個hub在脈管系統周圍形成，促進循環 T 細胞進入組織，為 T 細胞與其他細胞頻繁接觸以協調免疫反應提供平臺。

另一個hub以炎癥 CAF、單核細胞和中性粒細胞之間的炎癥正反饋回路為hub，位于管腔表面。結腸腫瘤的管腔表面有異常的上皮襯里，腫瘤塊突出到腸腔中，在那里它可以受到結腸內容物的磨蝕性損傷。組織損傷可能導致微生物配體進入或從死細胞中釋放免疫刺激配體，從而導致炎癥。炎癥反應可能與可導致肉芽組織的傷口愈合反應交織在一起。有趣的是，最近對小鼠的一項研究表明，損傷誘導的白細胞介素-1 (IL-1) 可以觸發 GREM1+ 間充質細胞中 RSPO3 的表達，這表明炎癥中樞與基質細胞的轉錄和空間重塑之間可能存在聯系我們在人類 CRC 中觀察到的隔室。事實上，我們在管腔表面觀察到擴張的血管，與先前在 CRC 中的研究一致，這些血管被表達基質金屬蛋白酶 (MMP) 的高度炎癥成纖維細胞包圍，已知有助于腫瘤血管生成和組織重塑。炎癥hub還具有 Treg 程序和包括 IL-17 在內的 T 細胞程序。 IL-17 已被證明可促進小鼠模型中的血管生成和腫瘤擴張，包括通過 CAF 激活和募集可支持腫瘤生長的粒細胞。因此，炎癥hub的多個特征與抑制抗腫瘤反應和促進腫瘤生長有關。

本文的研究提供了豐富的細胞狀態、基因程序及其在腫瘤中的轉化（例如在基質細胞中觀察到的深刻變化）的豐富數據集，涉及相對較大的 CRC 患者隊列。 基于基因程序的共變和隨后兩個免疫惡性hub的空間定位對幾個多細胞hub的預測將大量細胞狀態和程序組織成較少數量的細胞和過程協調網絡。 了解這些樞紐背后的分子機制并研究它們在治療時的時間和空間調節對于推進癌癥治療至關重要。

Method（我們關注重點方法）

scRNA-seq pre-processing and quality control filtering（這個地方質控部分更加精細）。

圖片.png

Selection of variable genes, dimensionality reduction and clustering（與我們常規做法也不太一樣，尤其降維用到了NMF）

圖片.png

Cluster assignment by gradient boosting and filtering of potential doublets

圖片.png

Classifying malignant cells by gradient boosting（腫瘤等級與層次，腫瘤研究中非常重要）。

圖片.png

Identification of gene expression programs by NMF（識別基因程序，這個之前分享過）

圖片.png

Identification of shared gene programs in malignant epithelial cells（識別共享的基因程序）

圖片.png

Calculating NMF transcriptional program activity（原理就是基因集打分）

圖片.png

Testing for covarying NMF expression programs（共表達程序）

圖片.png

Constructing a network of expression program similarity（構建表達程序相似性網絡）

圖片.png

Image analysis, neighborhood definition, and clustering（圖像方面的處理）

圖片.png

生活很好，有你更好