hello，大家好，我們的分析也慢慢進(jìn)入深水區(qū)了，很多方法需要聯(lián)合起來(lái)使用，如何靈活運(yùn)用各種方法，就需要我們的經(jīng)驗(yàn)和智慧了。今天分享的文獻(xiàn)在Multi-regional characterisation of renal cell carcinoma and microenvironment at single cell resolution，幾乎用到了我們常見的所有的單細(xì)胞的分析思路和方法，當(dāng)然了，生物學(xué)意義也進(jìn)行了很好的詮釋，尤其是利用單細(xì)胞數(shù)據(jù)calling Mutation，大家多多學(xué)習(xí)和積累。
放一張我覺的最關(guān)鍵的圖
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Abstract
腫瘤行為取決于癌細(xì)胞的致癌特性及其多細(xì)胞相互作用。 通過(guò)從 12 名腎腫瘤患者獲得的 270,000 個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和 100 個(gè)微解剖的完整外顯子組檢查這些依賴性(現(xiàn)在的單細(xì)胞數(shù)據(jù)都是以大數(shù)據(jù)量著稱)。 從腫瘤核心、腫瘤-正常界面、正常周圍組織和外周血的多個(gè)區(qū)域取樣組織(這個(gè)時(shí)候空間轉(zhuǎn)錄組更具有說(shuō)服力)。 發(fā)現(xiàn) CD8+ T 細(xì)胞克隆型的主要空間位置在很大程度上定義了衰竭狀態(tài)，而體細(xì)胞瘤內(nèi)異質(zhì)性無(wú)法解釋克隆型異質(zhì)性。 從單細(xì)胞 RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)中calling從頭突變使我們能夠譜系追蹤和推斷細(xì)胞的克隆性。 發(fā)現(xiàn)了六個(gè)區(qū)分腫瘤細(xì)胞功能的meta程序。 在腫瘤-正常界面富集的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化meta程序似乎通過(guò)巨噬細(xì)胞表達(dá)的 IL1B 進(jìn)行調(diào)節(jié)，可能形成治療靶點(diǎn)。
Introduction
Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) 是腎細(xì)胞癌 (RCC) 最常見的亞型，約占 RCC 病例的 75% 和the majority of deaths from kidney cancer。許多努力已經(jīng)表征了 ccRCC 的基因組landscape，揭示了重要的驅(qū)動(dòng)事件，例如 VHL 的雙等位基因失活（最常見的是伴隨著染色體 3p 的丟失和 VHL 中的突變/表觀遺傳沉默），隨后是染色質(zhì)重塑和組蛋白修飾相關(guān)的突變基因 PBRM1、BAP1 和 SETD2。已經(jīng)系統(tǒng)地研究了 ccRCC 演變過(guò)程中啟動(dòng)事件的時(shí)間。正如之前的多區(qū)域外顯子組測(cè)序研究所揭示的那樣，隨后突變事件的腫瘤內(nèi)異質(zhì)性 (ITH) 似乎是 ccRCC 的一個(gè)顯著特征。相比之下，ccRCC 在轉(zhuǎn)錄水平上的 ITH 不太清楚，部分原因是包含腫瘤微環(huán)境 (TME) 的多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)的復(fù)雜性。特別是，ccRCC TME 中惡性和非惡性細(xì)胞的表型異質(zhì)性及其與空間定位的關(guān)系仍然不清楚。
ccRCC 是一種免疫細(xì)胞大量浸潤(rùn)的癌癥類型。免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB) 治療已被證明可有效提高患者的生存率，突出了探索 ccRCC 免疫微環(huán)境的重要性。以前的研究使用批量測(cè)序分析了 ccRCC 的免疫狀況，這限制了它們剖析不同免疫細(xì)胞群的能力。使用質(zhì)譜流式細(xì)胞術(shù)的 ccRCC 綜合免疫圖譜揭示了 ccRCC 腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中的免疫細(xì)胞多樣性。單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq) 的最新進(jìn)展及其在癌癥研究中的應(yīng)用徹底改變了我們對(duì)腫瘤細(xì)胞表型異質(zhì)性、腫瘤免疫landscape、TME 的復(fù)雜性和可塑性以及 TME 中細(xì)胞間通訊的理解。具體而言，在 ccRCC 中，最近的一項(xiàng) scRNA-seq 研究提供了支持其起源于近端腎小管細(xì)胞的證據(jù)。其他研究利用 scRNA-seq 研究 ccRCC 的免疫狀況，主要關(guān)注 ICB 治療相關(guān)隊(duì)列和不同疾病階段，揭示與治療效果或疾病進(jìn)展相關(guān)的關(guān)鍵特征。
在考慮 TME 的異質(zhì)性時(shí)，感興趣的空間區(qū)域擴(kuò)展了與突變 ITH 相關(guān)的區(qū)域。更廣泛的目標(biāo)區(qū)域包括循環(huán)血液、腫瘤-正常界面或腫瘤假包膜（代表腫瘤與相鄰正常腎臟之間的邊界）、相鄰正常腎臟和腎周脂肪組織。假包膜的纖維結(jié)締組織似乎在空間上限制了生長(zhǎng)，侵襲與腫瘤分期和分級(jí)相關(guān)。由于 RCC 中的obesity paradox，腎周肥胖引起了人們的興趣，其中肥胖是診斷腎癌的最強(qiáng)風(fēng)險(xiǎn)因素之一，但也與腫瘤學(xué)結(jié)果的改善有關(guān)。了解 ccRCC 在腫瘤細(xì)胞、各種免疫/基質(zhì)細(xì)胞方面的空間異質(zhì)性和進(jìn)化，以及它們?cè)诟鼜V泛的 TME 中的相互作用仍然缺乏。為了解決這個(gè)問(wèn)題，對(duì) 12 名患者進(jìn)行了基于多區(qū)域的 scRNA-seq，對(duì)外周血、正常腎臟、腫瘤核心的四個(gè)不同空間區(qū)域和腫瘤-正常界面進(jìn)行了采樣，同時(shí)對(duì)激光捕獲顯微切割進(jìn)行了局部詳盡的外顯子組測(cè)序(LCM) 衍生的腫瘤樣本。
Results
Multi-region based genomic and single-cell transcriptomic profiling of RCC
對(duì) 12 名接受放射學(xué)診斷腎腫瘤手術(shù)切除的患者進(jìn)行了多區(qū)域基因組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組分析。 在組織病理學(xué)檢查后，12 名患者中有 10 名的腫瘤被評(píng)估為 ccRCC，1 名（PD47172）為嗜酸細(xì)胞瘤，1 名（PD44714）為大的良性厚壁囊腫。 在每位患者中，從外周血、正常腎臟、腫瘤核心的四個(gè)不同空間區(qū)域以及腫瘤-正常界面采集組織。 此外，如果有的話，還從腎周脂肪、正常腎上腺、腎上腺轉(zhuǎn)移和腫瘤血栓中取樣。
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在可以從這些樣本中提取足夠數(shù)量的活單細(xì)胞的情況下，使用 10x 平臺(tái)進(jìn)行了基于液滴的 5' scRNA-seq 和 T 細(xì)胞受體 (TCR) 富集。 同時(shí)，在執(zhí)行全外顯子組測(cè)序 (WES) 之前，使用 LCM 從每個(gè)含有腫瘤組織的區(qū)域解剖每個(gè)患者的微活檢樣本。 LCM 方法使我們能夠通過(guò)詢問(wèn)亞毫米大小的活檢來(lái)探索 ITH 的極限。 基于 WES 數(shù)據(jù)，確定了在 ccRCC 中報(bào)告為復(fù)發(fā)/驅(qū)動(dòng)事件的基因組改變。 9 名 ccRCC 患者中有 7 名（一名 ccRCC 患者沒有數(shù)據(jù)）具有 VHL 突變，4 名具有 PBRM1 突變，3 名攜帶 BAP1 突變。 在所有 9 名患者中都檢測(cè)到染色體 3p 的拷貝數(shù)丟失。 嗜酸細(xì)胞瘤攜帶整個(gè) 1 號(hào)染色體的特征性拷貝數(shù)丟失。
使用 scRNA-seq，在嚴(yán)格的質(zhì)量控制后從大約 270,000 個(gè)細(xì)胞中捕獲轉(zhuǎn)錄組，根據(jù)典型標(biāo)記基因的表達(dá)可以將其大致分為 12 種主要細(xì)胞類型
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由于合適的單細(xì)胞分離方案，T 細(xì)胞（表達(dá) CD3D、CD3G 和 CD3E）在數(shù)據(jù)中最為豐富，其次是骨髓細(xì)胞（表達(dá) CD68 和 CD14）和自然殺傷 (NK) 細(xì)胞（表達(dá) NCR1 和 KLRC1 )。還捕獲了大量其他免疫細(xì)胞群：B 細(xì)胞（表達(dá) CD79A 和 MS4A1）、漿細(xì)胞（表達(dá) IGKC 和 IGHG1）、肥大細(xì)胞（表達(dá) TPSAB1 和 TPSB2）和漿細(xì)胞樣樹突細(xì)胞（pDC；表達(dá) IRF7 和 LILRA4） .除了免疫區(qū)室，數(shù)據(jù)中還鑒定了四種基質(zhì)細(xì)胞類型：內(nèi)皮細(xì)胞 (EC)（表達(dá) PLVAP 和 TIMP3）、成纖維細(xì)胞（表達(dá) ACTA2 和 TAGLN）、近端腎小管 (PT) 細(xì)胞（表達(dá) SLC22A8 和 GPX3）和非 PT 上皮細(xì)胞（表達(dá) DEFB1 和 UMOD）。從 scRNAseq 數(shù)據(jù)推斷，RCC 腫瘤細(xì)胞在特異性表達(dá) CA9 并在其基因組中具有廣泛拷貝數(shù)變異 (CNV) 的cluster內(nèi)被鑒定出來(lái)。接下來(lái)，我們研究了 12 種主要細(xì)胞類型的起源組織，并觀察了這些細(xì)胞類型的不同組織分布（分析中合并了四個(gè)區(qū)域）
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- 注：(A) Heatmap illustrating the clinical features (left panel) and the genomic landscape (middle panel) and copy number profiles (right panel) of the tumours sequenced. (B) UMAP, (C) cell type, and (D) sampled region depicting the interpatient variability of scRNA-seq results. (E) UMAP showing marker gene expression for all cells. (F) Copy number inference based on scRNA-seq data.
進(jìn)一步研究中涵蓋的主要細(xì)胞區(qū)室進(jìn)行了亞群聚類分析。 NK 細(xì)胞的亞群產(chǎn)生了 14 個(gè)具有差異表達(dá)基因 (DEG) 和異質(zhì)組織來(lái)源的cluster。在這些cluster中，確定了眾所周知的 CD56 (NCAM1) 和 CD16 (FCGR3A) 表達(dá)群體。先天淋巴細(xì)胞 (ILC) cluster的特征在于 IL7R 和 FXYD7 的表達(dá)。兩個(gè) NK cluster（cluster 2 和 6）顯示干擾素γ（IFNG）的高表達(dá)，cluster 6 也高表達(dá)細(xì)胞因子 CCL4L2，并可能在正常腎上腺中富集。確定了一些特征較少的 NK cluster，例如cluster 4，它特異性表達(dá) KRT81 和 KRT86。這種 NK 細(xì)胞亞群之前曾在肝細(xì)胞癌中報(bào)道過(guò)，但其功能尚不清楚。 B/漿細(xì)胞區(qū)室被分為 13 個(gè)cluster，其中確定了眾所周知的主要 B 細(xì)胞群，如幼稚、轉(zhuǎn)換記憶和非轉(zhuǎn)換記憶 B 細(xì)胞。活化的 B 細(xì)胞（AREGhigh 和 RHOBhigh cluster）可能在腫瘤中富集，而 AREGhigh cluster在腎周脂肪中更富集。與主要細(xì)胞類型的外周血組織分布相比，發(fā)現(xiàn)血漿 IgA、IgG 和循環(huán)細(xì)胞（分別表達(dá) IGHA1、IGHG1 和 MKI67）在組織中富集。
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- 注：(A&E) UMAPs, (B&F) dotplots of marker genes, (C&G) tissue distribution, and (D&H) regional enrichment of NK and B cells.
CD8+ T cell lineages reveal evolutionary trajectories and the influence of spatial location on exhaustion
T 細(xì)胞包含數(shù)據(jù)中最豐富的細(xì)胞類型，大致分為兩個(gè)主要部分：CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞（包括 gamma delta T 細(xì)胞）。 CD8+ T 細(xì)胞區(qū)室的亞聚類導(dǎo)致鑒定出 18 個(gè)具有不同 DEG 和異質(zhì)組織位置的cluster。
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總的來(lái)說(shuō)，根據(jù)典型標(biāo)記基因的表達(dá)確定了典型的 CD8+ T 細(xì)胞cluster，它們代表了不同的 T 細(xì)胞功能狀態(tài)，包括幼稚、效應(yīng)、記憶、前功能障礙和功能障礙。發(fā)現(xiàn)高表達(dá) LEF1 和 CCR7 等基因的幼稚/中樞記憶 (CM) CD8+ T 細(xì)胞主要在外周血中富集。鑒定了常駐記憶 (RM) T 細(xì)胞，因?yàn)樗鼈儽磉_(dá)組織駐留標(biāo)志物（即 ITGAE 和 CD69），并且主要在正常腎臟中富集。特別是，cluster 10 還高表達(dá) CXCL13，它可能在 B 細(xì)胞募集和三級(jí)淋巴結(jié)構(gòu)的形成中發(fā)揮潛在作用。我們發(fā)現(xiàn)cluster 6 高度表達(dá) FGFBP2 和 CX3CR1，并且在外周血中大量富集，因此該cluster可能代表最近激活的效應(yīng)記憶 T 細(xì)胞（CD8+ T_EMRA）。基于包括 LAG3、TIGIT、PDCD1、HAVCR2 和 CTLA4 在內(nèi)的基因表達(dá)升高，鑒定了兩個(gè)耗盡的 T 細(xì)胞cluster（cluster 7 和 8）。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)cluster 8 具有最高的 LAG3 表達(dá)，并特異性表達(dá)免疫抑制細(xì)胞因子 IL10。該cluster可能代表具有極高效應(yīng)子和功能障礙水平的 CD8+ T 細(xì)胞，它們通過(guò)產(chǎn)生 IL-10 發(fā)揮調(diào)節(jié)功能。發(fā)現(xiàn)粘膜相關(guān)不變性 T (MAIT) 細(xì)胞高表達(dá) TRAV1-2 和 IL7R。鑒定出兩個(gè)循環(huán)細(xì)胞cluster：一個(gè)（表達(dá)MCM5和PCNA）代表細(xì)胞周期G1/S期的細(xì)胞，另一個(gè)（表達(dá)TOP2A和MKI67）代表G2/M期的細(xì)胞。除了傳統(tǒng)的 CD8+ T 細(xì)胞cluster，我們還鑒定了兩個(gè) gamma delta T 細(xì)胞cluster：gdT_Vd1（表達(dá) TRDV1）和 gdT_Vd2（表達(dá) TRDV2）。我們還對(duì) CD4+ T 細(xì)胞群進(jìn)行了亞群聚類分析，揭示了各種亞型，例如 CD4+ na?ve/CM 和 CD4+ 調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞 (Tregs) 及其不同的組織分布.
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- 注：(A) UMAP of the subclustering result, (B) UMAP and (C) barplot showing tissue distribution, and (D) regional enrichment of CD8+ T cell population. (E) UMAP showing the RNA velocity result and (F) exhaustion score across the pseudotime trajectory of CD8+ T cells. (G) UMAP of the sub-clustering result, (H) dotplot showing marker gene expression, and (I) UMAP of tissue distribution of CD4+ T cells. (J) Barplot showing the comparison of TCR clonal expansion between CD8+ and CD4+ T cells, breaking down into three different locations: blood, tumour and other regions
接下來(lái)，我們使用 Monocle 3 和 RNA 速度分析對(duì) CD8+ T 細(xì)胞進(jìn)行了偽時(shí)間軌跡分析，不包括 gamma delta T 和循環(huán)cluster。沿著假時(shí)間軌跡，我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞毒性相關(guān)基因（即 KLRG1、GNLY 和 GZMH）是逐漸下調(diào)而功能障礙相關(guān)基因（即 CTLA4、HAVCR2 和 LAG3）逐漸上調(diào)。典型的 T 細(xì)胞功能障礙前相關(guān)基因（即 CXCR4、GZMK 和 GZMA) 最初被上調(diào)，然后沿著偽時(shí)間軌跡下降。因此，這個(gè)偽時(shí)間軌跡概括了 CD8+ T 細(xì)胞從細(xì)胞毒性狀態(tài)經(jīng)過(guò)功能障礙前狀態(tài)到功能障礙狀態(tài)的進(jìn)展，同時(shí)耗竭程度逐漸升高。假時(shí)間和耗竭評(píng)分之間的正相關(guān)也支持這種進(jìn)展。此外，將前 10 個(gè)擴(kuò)展的 TCR 克隆型投影到軌跡上導(dǎo)致觀察到單個(gè) TCR 譜系通常僅限于類似的表型狀態(tài)，而不是分布在整個(gè)軌跡上。在所有腫瘤中，發(fā)現(xiàn) 90% 的具有 23 個(gè)或更多細(xì)胞的克隆型被限制在假時(shí)間值范圍內(nèi)（Wilcoxon 檢驗(yàn)，p < 0.05）。在多位患者中觀察到每個(gè)克隆超過(guò) 100 個(gè)細(xì)胞的高度擴(kuò)增的 TCR 克隆，其中顯著高達(dá) 30% 的 CD8+ T 細(xì)胞可以來(lái)自單個(gè)克隆型。相比之下，與 CD8+ 群體中的 TCR 克隆型相比，CD4+ 群體中的 TCR 克隆型擴(kuò)展較少。許多擴(kuò)增最多的 CD8+ TCR 克隆具有相當(dāng)比例的循環(huán)細(xì)胞，但在較少消耗的克隆型中觀察到的情況除外。這一發(fā)現(xiàn)表明 RCC 中高度耗竭的 T 細(xì)胞的增殖并未完全停止，類似于先前在黑色素瘤中的發(fā)現(xiàn)。
檢查了血液中檢測(cè)到的 TCR 克隆型是否反映了在其他區(qū)域檢測(cè)到的那些。研究發(fā)現(xiàn)，無(wú)論克隆大小如何，平均耗竭程度（推斷的假時(shí)間）和在外周血中檢測(cè)到 CD8+ TCR 克隆的概率都具有很強(qiáng)的反相關(guān)性，以至于在血液中很少檢測(cè)到耗竭的克隆型。這一發(fā)現(xiàn)出乎意料，表明組織駐留的耗竭 CD8+ T 細(xì)胞克隆似乎不會(huì)在外周血中再循環(huán)。為了進(jìn)一步說(shuō)明 T 細(xì)胞耗竭、克隆擴(kuò)增及其組織分布之間的關(guān)系，我們根據(jù) CD8+ T 細(xì)胞是單細(xì)胞還是擴(kuò)增以及它們的主要組織位置（血液、正常組織或腫瘤）對(duì)它們進(jìn)行分類。腫瘤中擴(kuò)增的 T 細(xì)胞進(jìn)一步細(xì)分為出現(xiàn)在所有腫瘤區(qū)域的那些和不出現(xiàn)的（腫瘤同質(zhì)和異質(zhì)）。值得注意的是，CD8+ T 細(xì)胞的表型狀態(tài)，就耗竭程度而言，表現(xiàn)出對(duì)克隆擴(kuò)增和組織位置的強(qiáng)烈依賴。同時(shí)，clones that were private to one tumour region were not significantly more exhausted than those shared between different regions 。
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- 注：(A) Dotplot showing marker gene expression defines principal CD8+ cell types. EM, effector memory; Act, activated; EFF, effector; EX, exhausted. (B) UMAP depicting the pseudotime inference of CD8+ cells。 (C) Expression of canonical exhaustion markers across cells ordered by pseudotime analysis. All marker genes are statistically significant across pseudotime values (q value = 0). (D) UMAP showing the 10 most expanded clones from patient PD43948. Grey dots represent cells outside the 10 most expanded clones. (E) Boxplot depicting the most expanded clonotypes (>100 cells) across all patients, ordered by their mean pseudotime values, showing the median, interquartile range and outlier pseudotime values (top panel); barplots showing the maximum expansion for the most expanded region (middle panel) and percentage of cycling cells (lower panel). (F) The probability of detecting a given TCR clone in peripheral blood as a function of minimal clone size and mean pseudotime value of the clone. (G) Mean pseudotime values based on the categorisation of clonotypes according to their principal region of enrichment.
Spatial localisation rather than intra-tumoural heterogeneity primarily influences CD8+ clonotypic heterogeneity
使用從 WES 數(shù)據(jù)中calling的體細(xì)胞突變，構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹來(lái)闡明我們研究中腫瘤中的克隆進(jìn)化和 ITH。 總體而言，我們發(fā)現(xiàn)所有腫瘤克隆共享一個(gè)長(zhǎng)主干但有短分支
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- 注：Reconstructed phylogenies from WES of multi-regional LCM biopsies. Each node represents a mutant clone present in one or more of the biopsies.
這表明大多數(shù)體細(xì)胞突變?cè)趥€(gè)體腫瘤中普遍存在，只有少數(shù)個(gè)體突變被檢測(cè)到。大多數(shù)檢測(cè)到的驅(qū)動(dòng)突變和關(guān)鍵 CNV（即 VHL 突變和染色體 3p 雜合性丟失 (LOH)）由個(gè)體腫瘤內(nèi)的所有腫瘤克隆共享，因此位于系統(tǒng)發(fā)育樹的樹干上。此外，根據(jù)變異等位基因頻率分布，我們測(cè)序的絕大多數(shù) LCM 樣本都出現(xiàn)了克隆性。綜上所述，WES 顯示我們隊(duì)列中腫瘤的 ITH 范圍是有限的。先前的研究通過(guò)比較在來(lái)自腫瘤不同空間定位的樣本中檢測(cè)到的體細(xì)胞突變，廣泛研究了各種癌癥的腫瘤內(nèi)遺傳異質(zhì)性。然而，體細(xì)胞異質(zhì)性對(duì)不同空間定位的局部腫瘤微環(huán)境的影響，尤其是抗腫瘤免疫反應(yīng)，在很大程度上仍未得到表征。在這里，我們系統(tǒng)地比較了個(gè)體腫瘤中 CD8+ T 細(xì)胞的體細(xì)胞突變、空間定位和 TCR 克隆型之間的關(guān)系。
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- 注：Comparison of WES derived phylogenies (left) with geographic location (centre) and CD8+ TCR clonotype expansion (right). Colours reference somatic clones to spatial localisation. Each column in the right panel represents a TCR clonotype, those with significant regional enrichment are highlighted in red. a, c, d, and e represents four different regions of the tumour core; g, tumour-normal interface; n, normal kidney; b, peripheral blood; h, normal adrenal gland.
出乎意料的是，發(fā)現(xiàn) T 細(xì)胞克隆型在不同的空間定位中具有高度異質(zhì)性和差異性，即使在僅觀察到體細(xì)胞突變異質(zhì)性可忽略不計(jì)的腫瘤區(qū)域也是如此。 在腫瘤細(xì)胞上產(chǎn)生新抗原的體細(xì)胞突變被認(rèn)為是抗原呈遞時(shí) T 細(xì)胞克隆擴(kuò)增的驅(qū)動(dòng)因素。 我們的發(fā)現(xiàn)表明 TCR 克隆擴(kuò)增的異質(zhì)性更多地與 T 細(xì)胞在組織中的不同空間定位相關(guān)，而不是與體細(xì)胞突變的 ITH 相關(guān)。 為了正式檢驗(yàn)這一點(diǎn)，我們計(jì)算了 T 細(xì)胞克隆型距離與 1) 突變距離之間的相關(guān)性； 2）空間定位距離
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- 注：Scatter plot of the Mantel correlation between tree distances. x-axis represents the correlation coefficient between WES derived clones and TCR clonotype distances. y-axis represents the correlation coefficient between spatial localisation and TCR clonotype distances.、
通過(guò)比較這兩種相關(guān)性，我們發(fā)現(xiàn) CD8+ T 細(xì)胞中的 TCR 異質(zhì)性與空間定位而非體細(xì)胞異質(zhì)性的相關(guān)性更強(qiáng)（配對(duì) Wilcoxon 檢驗(yàn)，p < 0.05）。
Precise de novo somatic mutation calling from scRNA-seq data
從轉(zhuǎn)錄組序列檢測(cè)單個(gè)細(xì)胞內(nèi)的體細(xì)胞突變可能有助于推斷它們的克隆關(guān)系。 盡管理論上可以從 scRNAseq 數(shù)據(jù)中calling突變，但目前沒有高精度的方法可用。 在這里，我們開發(fā)了一種算法/pipeline來(lái)從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)執(zhí)行從頭體細(xì)胞突變calling。 簡(jiǎn)而言之，我們?cè)诔跏歼^(guò)濾步驟之前使用 bcftools 從單細(xì)胞 BAM 文件中calling突變，以去除單個(gè)細(xì)胞中存在的突變和不同細(xì)胞譜系之間共享的突變。 在應(yīng)用二項(xiàng)式過(guò)濾器之前，我們檢查了初始步驟中calling的所有位點(diǎn)的參考和變異等位基因計(jì)數(shù)。 然后，我們?cè)趯?duì)變體進(jìn)行注釋后應(yīng)用了一組最終的過(guò)濾指標(biāo)
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- 注：Schematic of the de novo mutation calling algorithm.
為了對(duì)我們的突變calling方法進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，我們首先比較了從腫瘤細(xì)胞的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)calling的體細(xì)胞突變與從腫瘤 WES 數(shù)據(jù)calling的那些突變。所有檢測(cè)到的突變都被歸類為真陽(yáng)性（由突變calling檢測(cè)到，或未被突變calling者calling但在原始數(shù)據(jù)中有足夠的支持證據(jù)）、假陽(yáng)性、假陰性或不確定（其中突變?cè)跊]有足夠的 WES 覆蓋來(lái)驗(yàn)證呼叫）。總體而言，我們的方法取得了良好的性能，精度為 0.64（僅考慮外顯子突變時(shí)為 0.70），靈敏度為 0.53。我們還能夠在 CD8+ T 細(xì)胞中對(duì)該方法進(jìn)行基準(zhǔn)測(cè)試，結(jié)果表明 84% 的被calling突變僅限于單個(gè) TCR 克隆。這證實(shí)了預(yù)期的發(fā)現(xiàn)，即在 CD8+ T 細(xì)胞中calling的大多數(shù)突變僅限于克隆型，因?yàn)樵谛叵俪墒烨?T 細(xì)胞克隆之間可以共享的突變數(shù)量非常有限。
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- 注：Benchmarking results for scRNA-seq derived calls against WES data for each patient donor
使用這些突變calling，我們研究了不同細(xì)胞類型表達(dá)的突變數(shù)量，這可能有助于揭示它們的克隆擴(kuò)增程度。我們計(jì)算了具有一個(gè)、兩個(gè)、三個(gè)或三個(gè)以上突變的細(xì)胞的比例。我們需要來(lái)自每個(gè)細(xì)胞譜系和患者的至少 100 個(gè)細(xì)胞來(lái)解釋稀有細(xì)胞群中缺乏辨別力的問(wèn)題。正如預(yù)期的那樣，表達(dá)所謂突變的細(xì)胞數(shù)量最多的譜系是腫瘤細(xì)胞，這主要由譜系的已知克隆結(jié)構(gòu)來(lái)解釋，但也由于與正常細(xì)胞類型相比突變負(fù)擔(dān)增加的可能性。出于類似的原因，基質(zhì)細(xì)胞通常不會(huì)有可辨別數(shù)量的細(xì)胞具有不止一種被稱為突變的細(xì)胞。然而，我們觀察到大量表達(dá)突變的骨髓細(xì)胞，表明這些細(xì)胞中有相當(dāng)大的比例是無(wú)性系相關(guān)的。隨后是成纖維細(xì)胞和 CD8+ T 細(xì)胞（我們知道這些細(xì)胞是根據(jù) TCR 測(cè)序結(jié)果進(jìn)行克隆擴(kuò)增的）。極少比例的 CD4+ T 細(xì)胞表達(dá)突變，與基于 TCR 分析的低克隆度一致。
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- 注：Somatic mutation analysis and the relationship with TCR heterogeneity. (A) Density plots showing the VAF distribution of mutations called from WES data from LCM biopsies of tumour samples. (B) Comparison of WES derived phylogenies (left) with geographic location (centre) and CD8+ TCR clonotype expansion (right) for each patient with matching data. Colours reference somatic clones to spatial localisation. Each column in the right panel represents a TCR clonotype, those with significant regional enrichment are highlighted in red. a, c, d, and e represents four different regions of the tumour core; g, tumour-normal interface; f, perinephric fat; n, normal kidney; b, peripheral blood; h, normal adrenal gland; i, adrenal metastasis; t, thrombus. (C) Bar chart showing benchmarking results of the number of called mutations in CD8+ T cells derived from scRNA-seq data that are restricted to individual TCR clonotypes. (D) Comparison of the proportion of cells with one, two, three, and more than three mutations across the major cell types.
Regional characterisation and evolution of myeloid populations
Overall, we captured transcriptomes from 50,603 myeloid cells in our dataset, which were categorised into 19 clusters in sub-clustering analysis
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我們首先根據(jù)典型標(biāo)志物的表達(dá)和細(xì)胞的組織起源對(duì)這些cluster進(jìn)行了廣泛的注釋
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cluster 1、2、3 和 4 主要存在于血液中，CD14 高表達(dá)但缺乏 FCGR3A 表達(dá)，因此代表循環(huán)經(jīng)典單核細(xì)胞。 cluster 5 代表循環(huán)非經(jīng)典單核細(xì)胞，具有 FCGR3A 高表達(dá)但缺乏 CD14 表達(dá)。 我們確定了三個(gè)樹突狀細(xì)胞 (DC) cluster：pDC、1 型和 2 型常規(guī) DC（cDC1 和 cDC2），分別以 JCHAIN、CLEC9A 和 CD1C 的特異性表達(dá)為特征。 與其他區(qū)域相比，cDC1 在三個(gè) DC cluster中顯示出在腫瘤核心中的富集。 我們發(fā)現(xiàn)以 TPSAB1 特異表達(dá)為特征的肥大細(xì)胞可能在腫瘤核心中富集，這與之前的報(bào)道一致。 值得注意的是，我們根據(jù) CD163 和 C1QC 的高表達(dá)確定了 9 個(gè)巨噬細(xì)胞cluster（cluster 6-8、11-16），反映了 RCC 中巨噬細(xì)胞群的顯著異質(zhì)性。
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- 注：Sub-clustering analysis of myeloid cell compartment. (A) UMAP depicting interpatient variation, (B) tissue distribution, and (C) patient contribution to the different regions sampled. (D) UMAPs showing marker gene expression in myeloid cells. (E) Scatter plot of M1 versus M2 polarisation for all of the macrophages showing individual cells (grey), and mean values for each subtype (coloured). (F) Heatmap plotting the similarity of myeloid clusters derived in our study (G) Violin plots showing expression levels of SPP1 and GPNMB across all myeloid cell subtypes.
為了進(jìn)一步表征我們數(shù)據(jù)集中的異質(zhì)巨噬細(xì)胞群，我們探索了 DEG 和九個(gè)巨噬細(xì)胞cluster的組織富集。 我們發(fā)現(xiàn)與其他正常組織相比，六個(gè)巨噬細(xì)胞cluster（cluster 11-16）優(yōu)先富集在腫瘤核心/界面中，因此被定義為腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）。 其余三個(gè)cluster（cluster 6、7、8）在正常組織中富集，被認(rèn)為是組織駐留巨噬細(xì)胞 (TR Mac)。 在六個(gè) TAM cluster中，MHC-II TAM（cluster 14）高表達(dá) HLA-DRB5、APOE 和 APOC1，與腫瘤-正常界面相比，腫瘤核心更富集。 相比之下，其他五個(gè) TAM cluster在腫瘤核心和界面中顯示出相當(dāng)程度的富集。 促炎性 TAM（clster 11）高表達(dá)趨化因子 CXCL9/10 和 NLRP3 炎癥小體組裝激活劑 GBP1/5，表現(xiàn)出 M1 極化的主要特征。
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FN1+ TAM（cluster 15）高表達(dá)纖連蛋白 1 (FN1) 和清道夫受體 MARCO，此前曾報(bào)道其為腎癌中的特定巨噬細(xì)胞亞群。我們發(fā)現(xiàn) FN1+ TAM 可能在 ccRCC 中促腫瘤，這反映在髓源性抑制細(xì)胞 (MDSC) 特征和 M2 極化基因的高表達(dá)上。我們?cè)谖覀兊臄?shù)據(jù)集中發(fā)現(xiàn)了一個(gè) SPP1+ TAM cluster（cluster 16），該cluster已在各種癌癥類型中有所報(bào)道，但在腎癌中不存在。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn) ccRCC 中的 SPP1+ TAM 表達(dá) GPNMB，并顯示出與先前研究確定的 GPNMB+ TAM 高度相似。考慮到我們還確定了一個(gè) GPNMB+ TAM cluster（cluster 15）并且可以在多個(gè) TAM cluster中檢測(cè)到 GPNMB 的表達(dá)，這一發(fā)現(xiàn)表明 SPP1+ TAM 可能代表 GPNMB+ TAM 的一個(gè)subset。除了表達(dá) SPP1，我們發(fā)現(xiàn) SPP1+ TAM 還表達(dá) TREM2 并具有高血管生成評(píng)分。 TREM2+ 巨噬細(xì)胞與各種生物和病理過(guò)程有關(guān)，例如肥胖和癌癥。
在三個(gè) TR Mac cluster中，TR Mac.2 高表達(dá)白細(xì)胞介素 IL1B 和表皮生長(zhǎng)因子受體配體 AREG，這可能反映了其在體內(nèi)平衡組織修復(fù)中的可能作用。 TR Mac.3，顯示SEPP1和MRC1的高表達(dá)，并且在正常腎上腺中極其富集。 有趣的是，TR Mac.3 表現(xiàn)出極高的 M2 表達(dá)和吞噬特征，并顯示出與促腫瘤 TAM cluster（即 FN1+ TAM）相似的通路激活。 在該數(shù)據(jù)集中，我們無(wú)法清楚地區(qū)分胚胎接種的組織巨噬細(xì)胞與單核細(xì)胞衍生的組織巨噬細(xì)胞。
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- 注：Heatmap showing the results of pathway enrichments of macrophage subsets using GSVA analysis
接下來(lái)，我們探索了在我們的研究中確定的不同 TR Mac 和 TAM 集群的潛在起源。 使用 RNA 速度分析，我們發(fā)現(xiàn)從循環(huán)單核細(xì)胞到組織中的巨噬細(xì)胞有兩個(gè)明顯的定向流動(dòng)：（1）經(jīng)典 mono.3 到 TR Mac.2 和（2）非經(jīng)典單核細(xì)胞到 TR Mac.1。 TR Mac.1 和 TR Mac.2 然后可能在組織中產(chǎn)生其他巨噬細(xì)胞
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- 注：UMAP with superimposed RNA velocity analysis of the monocyte and macrophage subsets with zoomed windows highlighting possible directional flows from monocytes to macrophages.
為了確定巨噬細(xì)胞亞群與循環(huán)單核細(xì)胞的關(guān)系，我們利用體細(xì)胞突變進(jìn)行譜系追蹤，其方式類似于通過(guò)共享 TCR 克隆型確定 T 細(xì)胞表型狀態(tài)的關(guān)系。 在這里，我們構(gòu)建了一個(gè)鄰接樹來(lái)描述不同單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞cluster的關(guān)系，利用從 scRNA-seq 數(shù)據(jù)calling的體細(xì)胞突變
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- 注：Neighbour-joining tree depicting the relationship of different monocyte and macrophage clusters, utilising the somatic mutations called from scRNA-seq data. The numbers of supporting votes in bootstrapping (100 times) are labelled.
我們發(fā)現(xiàn)循環(huán)單核細(xì)胞與組織中的巨噬細(xì)胞分離，與其他經(jīng)典單核細(xì)胞相比，非經(jīng)典單核細(xì)胞（cluster 5）與組織中的巨噬細(xì)胞顯示出更密切的關(guān)系。 我們的數(shù)據(jù)支持代表循環(huán)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞之間中間狀態(tài)的非經(jīng)典單核細(xì)胞，大多數(shù)巨噬細(xì)胞似乎來(lái)自單核細(xì)胞祖細(xì)胞而不是卵黃囊起源。
Regional heterogeneity of endothelial cells, fibroblasts and epithelial cells
我們?cè)跀?shù)據(jù)集中觀察到異質(zhì)基質(zhì)細(xì)胞群。 內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 區(qū)室的亞cluster顯示 11 個(gè)具有不同 DEG 和組織位置偏好的cluster。
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Pericytes（cluster 11），以 RGS5 和 TAGLN 的表達(dá)為特征，優(yōu)先富集在腫瘤核心中。發(fā)現(xiàn)一個(gè)小cluster（cluster 9）在腎周脂肪中極度富集，并高度表達(dá) TFF3 和 PDPN，因此代表淋巴 EC。其余 9 個(gè)cluster代表血管 ECs，其中cluster 10 代表循環(huán) EC，高表達(dá) TOP2A 和 MKI67。我們確定了三個(gè)潛在的腫瘤相關(guān) EC cluster：膠原蛋白 EC、IGFBP3+ EC 和 ACKR1+ EC，因?yàn)樗鼈冊(cè)谀[瘤組織中顯示出相當(dāng)多的富集。在這三個(gè)cluster中，發(fā)現(xiàn)膠原蛋白 EC（表達(dá) COL4A1 和 COL15A1）在界面中更加豐富，這可能通過(guò)細(xì)胞外基質(zhì) (ECM) 產(chǎn)生與其他細(xì)胞相互作用。 ACKR1+ EC 特異性表達(dá)非典型趨化因子受體 ACKR1，其支持免疫細(xì)胞的粘附和組織遷移。我們發(fā)現(xiàn) IGFBP3+ EC 也表達(dá)高水平的免疫抑制酶 IDO1，暗示其在 TME 中的免疫調(diào)節(jié)作用。我們發(fā)現(xiàn) CRHBP+ EC 和 IGF2+ EC 優(yōu)先富集在正常腎組織中，而 DNASEL3+ EC 顯示在正常腎上腺中富集
我們?cè)趕ub-clustering分析中確定了九個(gè)成纖維細(xì)胞（Fibro）cluster。 與 EC 類似，我們發(fā)現(xiàn)了一組成纖維細(xì)胞（cluster 8）高表達(dá)的膠原相關(guān)基因（COL1A1 和 COL6A2）并優(yōu)先富集在interface。
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這表明不同的產(chǎn)生 ECM 的基質(zhì)細(xì)胞傾向于在界面中富集和共定位，發(fā)揮不同的功能，包括細(xì)胞外環(huán)境重塑和細(xì)胞間相互作用。 MMP 纖維的特點(diǎn)是基質(zhì)金屬蛋白酶 MMP2、補(bǔ)體因子 CFD 和 lumican LUM 的高表達(dá)。 發(fā)現(xiàn) MMP 纖維富含腎周脂肪和腎上腺。 Cluster 7 高度表達(dá) MYH11、SNCG 和 RERGL，因此被認(rèn)為是平滑肌細(xì)胞 (SMC)，如成纖維細(xì)胞。 發(fā)現(xiàn) SMC 樣纖維在正常腎組織中富集
數(shù)據(jù)集中的正常上皮細(xì)胞群表現(xiàn)出預(yù)期的多樣性，并在sub-clustering分析中分為 13 個(gè)聚類。 我們鑒定了兩個(gè)近端腎小管 (PT) 細(xì)胞cluster（均表達(dá) NAT8 和 PDZK1IP1）：cluster 1 具有更高的金屬硫蛋白 MT1H 和 MT1G 表達(dá)，因此可能代表 PT3 細(xì)胞，而cluster 2 可能代表 PT1/2 細(xì)胞，因?yàn)樗憩F(xiàn)出更高的 PT2 標(biāo)記 SLC22A6，和 PT1 標(biāo)記 SLC5A12 和 SLC5A2。
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兩個(gè) Henle 環(huán)（LoH）cluster：cluster 3 代表升細(xì)肢（ATL）細(xì)胞，表達(dá) CLDN3 和 TACSTD2； cluster 8 代表厚升肢 (TAL) 細(xì)胞，其特征在于 SLC12A1 和 UMOD 的表達(dá)。 確定了三個(gè)集合管 (CD) 上皮細(xì)胞cluster：A 型插入細(xì)胞（表達(dá) SLC4A1）、B 型插入細(xì)胞（表達(dá) SLC4A9）和 CD 主細(xì)胞（表達(dá) AQP2 和 FXYD4）。 我們鑒定了特異性表達(dá) SLC12A3 的遠(yuǎn)曲小管 (DCT) 細(xì)胞（7 cluster）、高表達(dá) SLC8A1 和 CALB1 的連接小管細(xì)胞（10 cluster）、顯示 PSCA 和 KRT17 特異性表達(dá)的盆腔尿路上皮細(xì)胞（13 cluster）和足細(xì)胞（11 cluster） ) 專門表達(dá) PTGDS 和 PTPRO。
RCC expression meta-programmes show differential abundance at the tumour-normal interface and affects prognosis
為了探索腫瘤細(xì)胞群中的腫瘤內(nèi)表達(dá)異質(zhì)性，我們首先使用非負(fù)矩陣分解（NMF）定義了由每個(gè)腫瘤中的共表達(dá)基因組成的腫瘤內(nèi)表達(dá)程序。這些表達(dá)程序代表了每個(gè)腫瘤中僅由腫瘤細(xì)胞亞群高度表達(dá)的基因模塊，如代表性腫瘤 PD45816 中的 NMF 結(jié)果所示。總的來(lái)說(shuō)，我們從 10 個(gè) ccRCC 腫瘤中剖析了 45 個(gè)腫瘤內(nèi)表達(dá)程序。其中一些程序雖然是個(gè)體腫瘤中的亞群事件，但被發(fā)現(xiàn)由不同的腫瘤共享，因此被定義為 ccRCC 中腫瘤細(xì)胞表達(dá)的meta程序。通過(guò)聚類分析確定了六個(gè)meta程序。第一個(gè)meta程序 (MP1) 的特征是 FOS 和 JUN 等基因的表達(dá)，因此代表了腫瘤細(xì)胞中與應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)的特征。 MP2 由近端腎小管 (PT) 細(xì)胞特異性表達(dá)的基因 (即 NAT8 和 ACSM2B) 組成。腫瘤細(xì)胞中 PT 特征的存在證實(shí)了先前的發(fā)現(xiàn)，即 PT 細(xì)胞是 ccRCC 的細(xì)胞類型。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)第三個(gè)meta程序 (MP3) 富含 TGFBI 和 MT2A 等與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化 (EMT) 相關(guān)的基因。這表明 MP3 可以概括 ccRCC 中的 EMT 過(guò)程，這在之前的 RCC scRNA-seq 研究中尚未報(bào)道。 MP4 由 NEAT1 和 HCG18 等非編碼 RNA 基因組成，可能反映了一些壓力或細(xì)胞死亡 (CD) 相關(guān)的細(xì)胞狀態(tài)。 MP5 的特點(diǎn)是表達(dá) MHC-II 相關(guān)基因，如 CD74 和 HLA-DRA。 MP6中發(fā)現(xiàn)TOP2A、MKI67等基因，說(shuō)明該meta程序與腫瘤細(xì)胞增殖有關(guān)。
接下來(lái)，我們整合了來(lái)自十個(gè)腫瘤的腫瘤細(xì)胞，通過(guò)去除批次效應(yīng)來(lái)減輕患者間的異質(zhì)性。通過(guò)sub-clustering和 DEG 分析，我們驗(yàn)證了腫瘤細(xì)胞中六個(gè)meta程序的存在。我們計(jì)算了使用 NMF 破譯的六個(gè)meta程序的基因評(píng)分，并將它們映射到腫瘤細(xì)胞的 UMAP 上。這再次反映了在腫瘤細(xì)胞中亞群的meta程序的表達(dá)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn) PT 和 EMT 程序的表達(dá)顯示出反轉(zhuǎn)模式，這通過(guò)在 TCGA 樣本的大量 RNA-seq 數(shù)據(jù)中計(jì)算的 PT 和 EMT 分?jǐn)?shù)之間的反相關(guān)性得到進(jìn)一步證實(shí)。此外，我們發(fā)現(xiàn)與腫瘤核心相比，EMThigh 腫瘤細(xì)胞在腫瘤-正常界面（腫瘤的前沿）更豐富，這反映了 EMT 狀態(tài)代表腫瘤細(xì)胞更具侵襲性和遷移性的事實(shí)。 PT/EMT 程序的異質(zhì)表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的空間位置偏好相結(jié)合，以個(gè)體腫瘤為例。例如，在腫瘤 PD45815 中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)通過(guò) EMT 評(píng)分對(duì)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行排序時(shí)，PT 程序是反向表達(dá)的。同時(shí)，EMThigh腫瘤細(xì)胞傾向于定位在界面，而PThigh細(xì)胞相對(duì)更富集在腫瘤核心的R1和R2區(qū)域。最后，通過(guò)對(duì) TCGA 樣本的大量 RNAseq 數(shù)據(jù)進(jìn)行評(píng)分，我們發(fā)現(xiàn)根據(jù) TCGA 研究顯示出最差預(yù)后的 TCGA 分子亞型 m3，與其他亞型相比，顯示出顯著更高的 EMT 評(píng)分但較低的 PT 評(píng)分。這一發(fā)現(xiàn)表明我們的meta程序可以成為患者生存的潛在指標(biāo).
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注：RCC cell expression programmes, regional enrichment and prognosis. (A) Heatmap showing expression programmes derived in a representative patient using NMF. (B) Heatmap depicting shared expression meta-programmes across all patients. (C) UMAP representing clusters of tumour cell population. (D) Relative expression scores of meta-programmes in each RCC cell cluster (left) and the distributions of cells with different meta-programmes in tumour core and tumour-normal interface. (E) Cells from patient donors PD45815 and PD45816, ranked by decreasing EMT score with corresponding PT score and cell location. (F) Box plots showing the EMT and PT scores of TCGA samples in different molecular subtypes. ***, P < 0.001 (Wilcoxon rank sum test)
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Cellular interactions associated with spatial location reveal biological insights and promising therapeutic targets
為了表征 RCC 微環(huán)境中不同空間位置的細(xì)胞間通訊，我們使用 CellPhoneDB 評(píng)估了正常腎臟、腫瘤-正常界面和腫瘤核心中主要細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間相互作用。有趣的是，界面和腫瘤核心中 12 種主要細(xì)胞類型之間發(fā)生的細(xì)胞間相互作用的數(shù)量相對(duì)可比，即使我們排除了那些涉及腫瘤細(xì)胞的相互作用，也比正常腎組織中的數(shù)量高出約兩倍.接下來(lái)，我們比較了在正常腎臟、腫瘤-正常界面和腫瘤核心的不同細(xì)胞類型上表達(dá)的特定配體-受體對(duì)介導(dǎo)的細(xì)胞-細(xì)胞相互作用。首先，該分析揭示了腫瘤與正常微環(huán)境之間相互作用的顯著差異。例如，在 CD8+ T 細(xì)胞和 ECs 之間，我們發(fā)現(xiàn) EC 募集（CCL5-ACKR1）和免疫抑制（LGALS9-HAVCR2）信號(hào)在界面和腫瘤核心中更加活躍，反映了腫瘤中血管生成和免疫抑制水平的升高。到正常組織。其次，我們始終觀察到腫瘤邊緣和核心之間的差異。例如，由 PVR-TIGIT 介導(dǎo)的潛在免疫抑制相互作用分別在腫瘤核心中更活躍，而細(xì)胞生長(zhǎng)/遷移相關(guān)相互作用 IGF-IGF2R 在界面中更活躍。第三，界面處的腫瘤細(xì)胞表達(dá)轉(zhuǎn)錄物，預(yù)測(cè)其介導(dǎo)獨(dú)特的細(xì)胞間相互作用，可能促進(jìn)腫瘤發(fā)生。例如，在界面中，與腫瘤核心中的相比，髓系細(xì)胞表達(dá)增強(qiáng)的細(xì)胞遷移相關(guān)信號(hào)，可以與腫瘤細(xì)胞相互作用（THBS1-整合素α3β1）。
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- 注： (A) Comparison of the number of cell–cell interactions between cells present in the adjacent normal kidney, tumour-normal interface, and the tumour core. (B) Dot plots representing mean expression levels and significance of important differentially expressed ligand receptor pairs by spatial region.
我們的結(jié)果表明，具有高表達(dá) EMT 特征的腫瘤細(xì)胞（EMThigh 腫瘤細(xì)胞）優(yōu)先定位于腫瘤的前緣。這促使我們探索界面處是否存在任何可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞 EMT 的活躍細(xì)胞間相互作用。我們使用 NicheNet 分析將來(lái)自 TME 中細(xì)胞的配體與腫瘤細(xì)胞中的 EMT 程序聯(lián)系起來(lái)。從該分析中，我們發(fā)現(xiàn)巨噬細(xì)胞表達(dá)的配體可能調(diào)節(jié)在腫瘤細(xì)胞上表達(dá)的大量 EMT 基因。特別是，巨噬細(xì)胞來(lái)源的 IL1B 對(duì)這些 EMT 基因顯示出高度和廣泛的調(diào)節(jié)潛力，可能是通過(guò)腫瘤細(xì)胞中表達(dá)的受體 IL1R1。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn) IL1B 由 TR Mac.2 特異性表達(dá)，其再次在腫瘤正常界面優(yōu)先富集。總之，我們的研究結(jié)果表明，表達(dá) IL1B 的巨噬細(xì)胞 (TR Mac.2) 優(yōu)先存在于腫瘤-正常界面，通過(guò)產(chǎn)生 IL1B 上調(diào)腫瘤前沿腫瘤細(xì)胞中的 EMT 程序。這種致癌途徑可能最終促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲
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- 注： (C) Heatmap depicting the potential regulation of genes expressed by the EMT meta-programme and ligands expressed by macrophages. (D) Schematic illustrating the importance of IL1B signalling between IL1B+ macrophages and RCC cells in promoting EMT.
DISCUSSION
我們使用基于多區(qū)域的基因組和單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組測(cè)序來(lái)表征 ccRCC 的表型異質(zhì)性和多細(xì)胞生態(tài)系統(tǒng)。 總體而言，我們的研究描繪了 ccRCC 的 TME 的綜合圖譜以及 ccRCC 中已建立的 ITH，包括腫瘤細(xì)胞和免疫/基質(zhì)細(xì)胞的表型分類，以及它們?cè)?TME 中的細(xì)胞間通訊，主要與其地理定位相關(guān)。
擴(kuò)增的 CD8+ TCR 克隆型內(nèi)的細(xì)胞在很大程度上受到耗竭評(píng)分的限制。最近在黑色素瘤中報(bào)道了類似的觀察結(jié)果。克隆型的表型限制可能主要與給定克隆的時(shí)間成熟有關(guān)，而不是環(huán)境因素，因?yàn)閭€(gè)體腫瘤在完全不同的狀態(tài)下都具有克隆型。除了表型限制之外，我們還發(fā)現(xiàn)擴(kuò)增的 TCR 克隆型在一個(gè)或多個(gè)宏觀腫瘤活檢中也經(jīng)常受到空間限制。由于我們的研究中觀察到的體細(xì)胞突變的 ITH 有限，因此無(wú)法通過(guò)暴露于不同的突變相關(guān)新抗原來(lái)完全解釋 TCR 克隆擴(kuò)增的這種空間限制。我們無(wú)法在 TME 中定義任何其他可以預(yù)測(cè)這種克隆型空間異質(zhì)性的因素。感知到的 T 細(xì)胞克隆型的隨機(jī)定位可能是物理和環(huán)境因素驅(qū)動(dòng)細(xì)胞從外周循環(huán)到腫瘤駐留的初始遷移的結(jié)果。可以采用縱向取樣策略或方法來(lái)確定準(zhǔn)確的 T 細(xì)胞系統(tǒng)發(fā)育，以詢問(wèn) T 細(xì)胞擴(kuò)增和遷移的精確時(shí)間。我們對(duì)擴(kuò)增 TCR 克隆區(qū)域限制的觀察是否在其他癌癥類型中更廣泛地被發(fā)現(xiàn)，可能需要部署類似采樣和測(cè)序策略的額外研究。
外周 TCR 用于非侵入性癌癥檢測(cè)和監(jiān)測(cè)的效用顯示出前景，尤其是在循環(huán)腫瘤 DNA 片段稀缺的 RCC 中。 雖然我們發(fā)現(xiàn)在血液和腫瘤區(qū)域都存在許多擴(kuò)增克隆型，但我們觀察到衰竭程度與外周血中檢測(cè)到 TCR 克隆的概率呈負(fù)相關(guān)，以至于在血液中很少檢測(cè)到衰竭克隆型。 研究結(jié)果表明，一旦 T 細(xì)胞克隆浸潤(rùn)到腫瘤中并經(jīng)歷從激活到功能障礙的表型轉(zhuǎn)變，它們就很少再循環(huán)，這可能是由于 CD69 所證明的組織駐留表型。 因此，對(duì)腫瘤反應(yīng)性 TCR 的外周采樣更有可能檢測(cè)到耗盡的腫瘤駐留克隆的前因，而不是那些目前在腫瘤中活躍的克隆.
作者開發(fā)了一種策略 (deSCeRNAMut)，可以根據(jù)基于液滴的 scRNA-seq 數(shù)據(jù)準(zhǔn)確檢測(cè)不同細(xì)胞群中的體細(xì)胞突變。使用許多過(guò)濾指標(biāo)（包括不同細(xì)胞類型譜系之間共享胚胎后突變的不可信性）消除了缺乏一致覆蓋、低讀取深度和容易出錯(cuò)的測(cè)序讀取的主要挑戰(zhàn)。我們檢測(cè)到我們數(shù)據(jù)集中不同細(xì)胞譜系的體細(xì)胞突變，并確定了骨髓細(xì)胞中的高度克隆擴(kuò)增。我們使用從這種方法calling的體細(xì)胞突變來(lái)構(gòu)建巨噬細(xì)胞和單核細(xì)胞中的相鄰連接樹，以推斷非經(jīng)典單核細(xì)胞可能是腎癌中循環(huán)單核細(xì)胞和大多數(shù)組織駐留巨噬細(xì)胞之間的中間狀態(tài)。我們?cè)O(shè)想在未來(lái)，使用空間成像技術(shù)來(lái)可視化一系列細(xì)胞類型中表達(dá)基因的突變將有助于破譯多細(xì)胞 TME 的系統(tǒng)發(fā)育組織。
EMT meta程序是通過(guò)每個(gè)患者的腫瘤細(xì)胞亞群的表達(dá)來(lái)定義的，并且在我們的研究中由多個(gè) ccRCC 腫瘤共享。 更豐富的腫瘤細(xì)胞群和幫助規(guī)避具有挑戰(zhàn)性的批次變化的方法的使用使我們能夠發(fā)現(xiàn)這個(gè)以前未報(bào)告的特征。 EMT 程序在 ccRCC 腫瘤細(xì)胞中的表達(dá)與 PT 程序（一種上皮表達(dá)特征）的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。 同時(shí)，ccRCC中的EMThigh腫瘤細(xì)胞傾向于定位于腫瘤-正常界面，這是腫瘤的前沿和遷移邊緣。 這些發(fā)現(xiàn)與頭頸癌的 scRNA-seq 研究中報(bào)道的結(jié)果相似，反映了 EMT 的定義特征：細(xì)胞中上皮特征的喪失，有利于促進(jìn)其遷移和侵襲能力。
分析細(xì)胞間相互作用揭示了與 ccRCC 的 TME 中不同空間定位相關(guān)的預(yù)測(cè)細(xì)胞間通訊的異質(zhì)性。特別是，通過(guò)使用 NicheNet 連接配體和目標(biāo)基因，我們發(fā)現(xiàn) IL1B，由在腫瘤-正常界面 (TR Mac.2) 富集的組織駐留巨噬細(xì)胞亞群特異性表達(dá)，可能促進(jìn)腫瘤細(xì)胞進(jìn)行 EMT。據(jù)報(bào)道，IL1B 的表達(dá)與 RCC 的腫瘤分期呈正相關(guān)，并且與招募到癌癥基因組圖譜的患者中 RCC 患者的較差預(yù)后相關(guān)。此外，在 RCC 中抑制 IL1B 已顯示在 RCC 的同源小鼠模型中誘導(dǎo)腫瘤消退。 IL1B 阻斷劑也被證明可以減少動(dòng)脈粥樣硬化患者肺癌的發(fā)生率，目前正在幾項(xiàng)臨床試驗(yàn)中研究其使用。在我們的數(shù)據(jù)中，我們表明導(dǎo)致 IL1B 在 RCC 中不利作用的潛在機(jī)制通過(guò)巨噬細(xì)胞衍生的 IL1B 信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn) EMT 起作用。利用這一途徑可能在治療上是有用的。
Method
scRNA-seq merge and QC
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Cell type sub-clustering and annotation
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Pseudotime inference, TCR analysis
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De Novo Mutation Calling from scRNA-seq Data 重點(diǎn)
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Inferring copy number variations based on scRNA-seq data
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Cell subtype abundance in different tissues
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Correlation between spatial, somatic RCC evolution and TCR clonotype evolution
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Gene set enrichment analysis and gene signature scoring in macrophage population
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RNA velocity analysis
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Lineage tracing using scRNA-seq called somatic mutations
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Deciphering intra-tumour expression programmes and meta-programmes
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Integrating and analyzing tumour cells from different patients
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細(xì)胞通訊分析
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生活很好，有你更好
