hello，大家好，今天禮拜天，天津霧霾嚴重，呆在家里學習一下吧。今天給大家分享的是空間轉錄組的空間細胞密度的分析，這個分析非常重要，下面是一張展示圖。

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大家應該都有基本的常識，那就是組織是一個有序的細胞結構，細胞不會隨機出現在組織的各個區域，而是嚴格按照空間位置進行分布，當然了，受到了周圍細胞環境的很多影響，那么這個分析體現的就是細胞類型空間分布的有序性，那么疾病樣本細胞類型的空間分布，則體現了疾病對細胞空間排布的影響，文章在Spatially-resolved transcriptomics analyses of invasive fronts in solid tumors,很好的方法，今天我們就來分享這個內容。

Abstract

實體瘤是復雜的生態系統，異質性是克服腫瘤復發和轉移的主要挑戰。揭示腫瘤中細胞類型和功能狀態的空間異質性對于開發有效的治療方法至關重要，尤其是在腫瘤的侵襲前沿，即腫瘤細胞浸潤和侵襲最活躍的區域。作者首先使用具有納米級分辨率的 Spatial 增強分辨率組學測序（Stereo-seq，空間技術分辨率優于10X）來表征肝內膽管癌（ICC）的腫瘤微環境。在以腫瘤邊界兩側為中心的 500μm 寬區域（即腫瘤的侵襲前沿）中發現了獨特免疫細胞的富集、抑制性免疫微環境和腫瘤細胞的代謝重編程。此外，發現肝細胞的損傷狀態在侵襲性前沿中過度表達血清淀粉樣蛋白 A（SAA），募集巨噬細胞以促進進一步的腫瘤侵襲，從而導致更差的預后。還在肝細胞癌和其他肝轉移癌中證實了這些發現。這樣的分析突出了高分辨率空間解析轉錄組學方法的顯著潛力，為全面剖析腫瘤生態系統和指導實體瘤新治療策略的開發提供了有意義的生物學見解。

Introduction

實體瘤是復雜的器官樣結構，往往會擴散到附近的組織并通過淋巴系統和血流轉移到遠處的器官。 有證據表明，實體腫瘤是具有高度異質性的復雜生態系統，涉及癌細胞與免疫細胞和基質細胞等各種細胞類型以及細胞外基質（ECM）成分相互作用的區域。 具體來說，腫瘤浸潤邊緣區域，腫瘤細胞侵入paranormal tissues并遇到各種各樣的基質細胞和 ECM 成分，這是腫瘤細胞浸潤和侵襲最活躍的區域。 全面了解該領域的成分及其空間異質性，以及腫瘤細胞與腫瘤微環境 (TME) 之間的相互作用，將有助于了解腫瘤侵襲和轉移、評估預后并探索實體瘤的新治療方法。

單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq) 是在單細胞水平上研究細胞成分及其相互作用的強大工具，已被用于表征多種類型實體瘤的 TME。然而，空間信息的缺乏是研究局部環境、特定細胞間相互作用和腫瘤進展之間的相關性的主要障礙，尤其是在腫瘤浸潤邊緣區域。此外，由于先前研究中缺乏多區域采樣，單細胞分辨率的腫瘤內空間異質性仍然很差。最近開發的空間轉錄組學 (ST) 方法使用空間條形碼寡聚脫氧胸苷微陣列促進了整個組織切片上轉錄物的無偏映射。然而，在以前的研究中應用的大多數 ST 方法的分辨率都很低，可以識別與數十個細胞而不是單個細胞混合的斑點。最近，將 DNA 納米球 (DNB) 圖案化陣列芯片和原位 RNA 捕獲相結合，開發了具有納米級分辨率 (220 nm × 220 nm/spot) 和可擴展區域 (10 mm × 10 毫米），每個單元捕獲數百個數據點。因此，立體 seq 可以潛在地彌合 scRNA seq 和 ST 分析之間的差距，它們一起可以更好地表征整個腫瘤生態系統的功能和結構研究。因此，Stereo-seq 從腫瘤多區域組織中產生的單細胞和高維空間數據的整合將促進全面和無偏見的組織分析，以識別實體瘤中的腫瘤內異質性和 TME 細胞通訊，特別是對于腫瘤浸潤邊緣區域（空間技術倒是不錯，分析方法都是通用的）。

肝癌是全球最惡性的實體瘤之一，而肝內膽管癌 (ICC) 是第二大最常見的原發性肝癌，在過去幾十年中全球發病率不斷增加。 然而，大多數患者 (> 70%) 在由于局部晚期或轉移性疾病不能手術治療的診斷時間。在這項研究中，作者使用具有高分辨率和厘米級視野的立體序列來表征腫瘤生態系統的復雜性和異質性，以及它們在 ICC 中的細胞相互作用，通過分析四個區域位點，包括腫瘤組織 (T) 、邊緣區域 (B)、鄰近正常組織 (P) 和正常或轉移淋巴結 (LN)。通過將 ST 數據與 scRNA-seq 數據整合并使用生物信息學分析，分析方法確定了腫瘤侵襲前沿的高度細胞和轉錄異質性，其中腫瘤細胞侵入paranormal tissues。研究發現免疫逃逸能力增加，腫瘤細胞脂肪代謝增加，免疫細胞積累增加，尤其是在距腫瘤正常邊界 250 μm 以內的區域。此外，發現靠近侵襲前沿的肝細胞中 SAA1 和 SAA2 的表達增加，這與巨噬細胞局部募集的增加有關，并與 ICC 患者的預后較差相關。此外，在其他四個額外隊列中證實了這些發現在原發性和轉移性肝癌中。作者的研究強調了高分辨率、空間分辨轉錄組學方法在為實體瘤新治療策略的開發提供有意義的生物學見解方面的重要潛力。

Results

(1)Spatial resolved transcriptomics profiles of multi-regional tissues from ICC patients

為了表征 ICC 的空間轉錄景觀，使用高分辨率（220 nm × 220 nm/點）和可擴展的立體序列處理來自瘤內組織、鄰近正常組織、邊緣區域和正常或轉移淋巴結的新鮮冷凍組織 區域（10 mm × 10 mm）（下圖）。 從病理診斷為 ICC（LC0、LC1、LC2、LC4、LC5、LC6、LC7）的 8 名患者的 27 個樣本（T，6；B，8；P，7；LN，6）中生成了 50 張切片的立體序列數據 , 和 LC8) 使用相鄰載玻片的蘇木精和伊紅 (H&E) 染色。

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• 注：Schematic diagram of the spatial transcriptomics acquisition workflow based on 27 samples (T, 6; B, 8; P, 7; LN, 6) from eight patients with ICC with further data analysis. Liver cancers* include ICC (n = 10), HCC (n = 5), liver metastasis of colorectal cancer (n = 3), pancreatic cancer (n = 2), and lung cancer (n = 1).

. In the Discovery Cohort，從患者 LC5（604 個細胞）邊緣區域組織生成的 scRNA-seq 數據與最近發布的 ICC scRNA-seq 數據集相結合，以建立細胞類型的參考表達圖譜，以描繪每個組織切片中細胞類型群體的空間斷層掃描 . 結果，使用 Seurat 將 29,793 個合格細胞聚集成 11 個主要細胞類型，包括 T 細胞 (CD3D)、自然殺傷細胞 (NKs) (KLRF1)、B 細胞 (MS4A1)、漿細胞 (MZB1)、巨噬細胞 (CD163/ CD14)、樹突狀細胞 (DC) (CD1C)、膽管細胞/膽管癌細胞 (KRT19/EPCAM)、肝細胞 (ALB)、內皮細胞 (CDH5/ENG) 和成纖維細胞 (ACTA2)。

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對于 ST，每個 DNB 或 bin (220 nm × 220 nm) 檢測到 2~90 個（中位數為 8 個）轉錄本，每個肝細胞（直徑為 25~30 μm）大約有 2,500 個（50 × 50）個 bin 每個膽管癌細胞（直徑為 15 μm）約 900 (30 × 30) 個 bin

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• 注：Spatial transcriptomics (ST) spots were mapped to H&E staining of adjacent slides of LC4-T, and the raw spatial expression matrix with each bin/spot was convoluted into pseudo5 spots with 2.5 μm squares (5 × 5 bins/spot) to show unique molecular identifiers (UMI) counts of the cell nucleus (with a diameter of 15 μm) of a tumor cell by ST spots.

為了使用這些reference signatures進行空間細胞類型注釋，原始空間表達矩陣被轉換為 25 μm 平方大小（50 × 50 bins/spot）的SPot，大約代表一個細胞，平均 718 個基因和 1,644 每個spot檢測到的 mRNA 分子。

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• 注：Violin plots showing UMI counts (d) and numbers of genes (e) captured in 50 ST slides of 27 samples (T, n = 6; P, n = 7; B, n = 8; LN, n =6) from eight patients with ICC.

ST 載玻片中每個spot的細胞成分（50 × 50 bins/spot, 25 μm squares）由 SPOTlight （關于SPOTlight，大家可以參考文章SPOTlight助力單細胞和空間轉錄組聯合分析）使用 scRNA-seq 作為參考確定，然后在空間點中注釋 11 種主要細胞類型。

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將每個spot分配給顯示最高概率比例的特定細胞類型，因為第一個概率遠高于第二個概率(這個注釋在空間分析中很常見)。

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經典細胞類型標記基因在定義的細胞簇中明顯更高的表達支持了 ST 點細胞類型注釋的合理性

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（2）The heterogeneities of cell and ECM compositions as well as spatial distributions in multi-regions of ICC

ICC 患者的四個區域位點（T、P、B 和 LN）的細胞組成和空間分布高度異質。 不同區域在空間上具有不同的組織結構，由不同的主要細胞成分組成。 在腫瘤組織中，成纖維細胞、巨噬細胞和 B 細胞是最豐富的細胞，幾乎占所有細胞成分的一半

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• 注： (a) Pie graphs showing the percentages of major cell types in all cell components at four regional sites (T, n = 6; P, n = 7; B, n = 8; LN, n = 6) of eight patients with ICC. (b) H&E staining and heat maps of the spatial distributions of fibroblasts, T/NK cells, and B cells in four regional sites.

具體而言，在腫瘤組織中檢測到的成纖維細胞百分比高于其他三個區域，這意味著 ICC 腫瘤組織的高度促纖維化特性。 正如預期的那樣，肝細胞是鄰近正常組織中的主要細胞類型，其次是膽管細胞和 B 細胞。對于邊緣區域，除了腫瘤細胞和肝細胞外，成纖維細胞、B 細胞和巨噬細胞是最豐富的細胞類型。在LNs中，B細胞、T/NK細胞和巨噬細胞是最豐富的免疫細胞類型，B細胞廣泛分布在整個LN組織中。 與正常 LN 不同，在 LC4-LN（有 LN 轉移）中，腫瘤細胞覆蓋了玻片中幾乎一半的 LN 區域，而 B 細胞覆蓋了其余的正常區域。此外，在 T、P 和 B 中也檢測到由非淋巴組織中 DC、T/NK 和 B 細胞共聚集產生的典型三級淋巴結構 (TLS)，這通過 H&E 染色進一步證實

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• 注：The three-dimensional diagram and corresponding heat maps showing tertiary lymphoid structures (TLS) where DCs,T/NK, and B cells co-aggregated

  
  
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• 注：H&E staining and corresponding heat maps illustrating the location of tertiary lymphoid structures (TLS) featured with co-aggregation of B cells, T/NK cells, and DCs in LC6-B

此外，幾種細胞類型在具有高空間異質性的不同組織區域中表現出不同的富集。Most of the fibroblasts in tumor tissues showed matrix cancer-associated fibroblast (mCAF) signatures with increased expressions of ECM related genes (LUM, DCN, and COL3A1), while more antigen presenting cancer-associated fibroblasts (AP-CAF) and inflammatory cancer-associated fibroblasts (iCAF) were found in adjacent normal tissues。

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與鄰近的正常組織相比，腫瘤組織和邊緣區域中耗盡和細胞毒性 T 細胞之間的比率更高，表明 T 細胞的抑制狀態和隨后的 TME 中的癌癥免疫逃避。 將 T 細胞和 B 細胞細分為不同的亞群后，在 LN 中觀察到的初始 T 和初始 B 細胞的百分比顯著增加，并且空間初始 B 細胞主要被漿 B 細胞包圍。在空間細胞類型圖中也鑒定了以被 B 細胞包圍的 DC 聚集為特征的Germinal centers

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• 注：The H&E staining, cell type spatial maps and corresponding IF illustrating the structure of the lymph node including the germinal center and the distribution of subpopulations of main cell types in lymph nodes (LC7-LN).

除了成纖維細胞cluster和免疫細胞在不同部位的空間異質性分布外，腫瘤細胞在不同瘤內區域也表現出明顯的癌癥特征富集，表明不同組織之間以及腫瘤組織內的空間異質性。

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TME 由腫瘤細胞和 ECM 之間通過細胞-基質相互作用和 ECM 重塑的雙向通信動態塑造。 為了全面了解四個regional sites之間的 ECM 重構和細胞-基質相互作用，啟動了區域分割（1000 × 1000 bins 或 500 μm × 500 μm 每個點）以obtain approximately 400 spots of local bulk RNA profiles on each ST slide。 根據 ECM 相關基因和趨化因子/細胞因子基因的轉錄特征，從 48 張載玻片中捕獲的總共 20,400 個 ST spot被分成 10 個模式。

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• 注：Heat map showing the clustering of ECM components according to differentially-expressed genes in segmented spots. Different patterns, tissues and patients are labeled by colors

從不同患者收集的同一部位的分段 ST spot通過uniform manifold approximation and projection (UMAP) 進行可視化，表明特定部位的 ECM 和趨化因子/細胞因子富集的微環境。在腫瘤組織中，鑒定出HIF1A、CXCL6、IL18和MMP14等幾個高表達基因。基于 scRNA-seq 數據，MMP14 可通過降解基質屏障和增強血管生成促進腫瘤生長和侵襲，被確定為腫瘤中最富集的 MMP，主要由成纖維細胞和腫瘤細胞分泌。此外，IL18 編碼促進腫瘤進展的促炎細胞因子，在腫瘤中含量最高，主要由 DC、巨噬細胞和腫瘤細胞產生。在鄰近的正常組織中，與其他三個區域相比，包括 IL6R、IL1RAP 和 CXCL2 在內的 ECM 成分高表達。 發現趨化因子或細胞因子簇（包括 CXCL8 和 CXCL1）的表達主要在邊緣區域富集，表明這些區域有強烈的炎癥反應。具體而言，根據 scRNA-seq 數據，編碼炎癥反應的主要介質的 CXCL8 主要由髓細胞分泌，包括巨噬細胞和中性粒細胞。此外，與其他三個區域相比，CCL19/CCL21 及其受體 CCR7 在 LN 中的表達最為豐富，支持 CCL19/CCL21-CCR7 軸在指導淋巴細胞歸巢和組織免疫和炎癥反應中的關鍵作用。此外，共刺激分子相關基因（CD28 和 CD80）的表達，它們是 T 細胞擴增、存活和激活中最重要的分子，以及抑制分子相關基因（CTLA4、BTLA、TIGIT、CD96、CD274 和 LGALS9 ) 在 T 細胞失活中至關重要，都在 LN 中特異性積累，表明雙向和平衡的免疫調節。

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• 注：H&E staining and heat maps of the spatial expression of inhibitory related genes BTLA, TIGIT, CTLA4, CD96, and CD274 in corresponding slide of LC5-LN.

（3）Enrichment of distinctive immune cells, the suppressive immune microenvironment, and metabolic reprogramming of tumor cells at invasive fronts

邊界線周圍的區域，腫瘤細胞侵入超自然組織并與各種基質細胞和 ECM 成分直接接觸，已被認為是一個復雜的生態系統和實體瘤最重要的區域，用于了解腫瘤進展、免疫監視 , 侵犯正常組織。四個不同區域的細胞和 ECM 成分的轉錄景觀也表明邊緣區域炎癥趨化因子/細胞因子的富集。研究觀察到巨噬細胞和 NK/T 細胞在邊界附近的積累，其中腫瘤細胞與相鄰的肝組織直接接觸，包括復雜的邊界微環境

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因此，為了進一步表征侵襲性腫瘤細胞前沿的微環境，使用六層構建了一個精確分割侵襲性腫瘤前沿周圍邊緣區域的模型（每層是一個距離橫向邊界線寬度為 250 μm 的區域）。 方向，每層沿邊界線的軸向等分100等份）為雙側。

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• 注：Schematic diagram of the identification of borderlines and segmentation of margin areas to characterize the spatial heterogeneity of margin areas. Three layers with a width of 250 μm were drawn from the normal side and from the tumor side of the borderline, respectively,and each layer was divided into 100 subregions along the borderline

首先根據ST載玻片中腫瘤細胞和肝細胞的空間分布擬合邊緣區域的侵襲邊界線，并通過相應相鄰載玻片的H＆E染色證實，然后分析正常六層細胞成分的分數和特征和邊緣的腫瘤slides。發現免疫細胞從腫瘤側向邊界周圍區域募集，其軸向異質性高，尤其在靠近邊界的 250 μm 寬區域富集，revealing the high heterogeneities of immune cell distributions around the borderline in both the axial and lateral directions

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此外，發現成纖維細胞在腫瘤側富集，但在腫瘤側不同層之間的分數沒有明顯變化。在免疫細胞中，巨噬細胞、DC、T/NK 細胞和 B 細胞被發現在靠近腫瘤側邊界的區域更豐富。Moreover, the abundance of macrophages was found to be increased from the third layer (750-500 μm) and the second layer (500-250 μm) to the first layer (250-0 μm) in the tumor sides of the borderlines, while there was no change in adjacent normal tissues, further validated by IF result from 10 ICC patients from Validation Cohort 1 。觀察到抗炎巨噬細胞（M2 樣）而不是促炎巨噬細胞（M1 樣）的百分比顯著增加從外兩層（750-500 μm 和 500-250 μm）到第一層（250- 0 μm) 靠近腫瘤兩側的邊界線

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DCs 和 T/NK 細胞的百分比從第三層（750-500 μm）增加到靠近腫瘤側面邊界的第一層（250-0 μm），而 B 細胞的百分比從第二層增加到第一層。T 細胞亞型，包括細胞毒性和耗竭的 T 細胞，分散在邊緣區域中，邊緣周圍沒有任何積累。然而，BTLA、CTLA4、CD96、IDO1等免疫檢查點基因的表達在邊界線的腫瘤側富集，表明腫瘤側靠近邊界線區域的免疫細胞處于抑制性免疫狀態!

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相應地，與腫瘤側外層的腫瘤細胞相比，第一層的腫瘤細胞顯示出增強的免疫逃避特征

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總之，這些結果顯示了不同的 TME 特征，其中免疫細胞富集，包括巨噬細胞（M2 樣）、T/NK 細胞、DCs 細胞和來自腫瘤側的第一層（250-0 μm）的 B 細胞以及 在靠近入侵前沿邊界的兩側最近的層中具有更強的免疫抑制性微環境。

除了免疫細胞分布的空間異質性和侵襲前沿的不同免疫抑制微環境外，我們進一步表征了邊界線周圍細胞成分（主要由肝細胞組成）的代謝變化和增殖能力。 一般來說，與邊界線旁腫瘤側的所有細胞相比，腫瘤側的腫瘤細胞表現出較低的缺氧相關途徑和較高的糖酵解水平

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與相應的外部區域相比，與邊界線最近的雙側層顯示出更高的缺氧相關通路激活。與缺氧水平趨勢一致，交界旁腫瘤旁第一層細胞糖酵解水平明顯高于外層。Although there was no difference in glycolysis levels of tumor cells among different layers, upregulated levels of tricarboxylic acid cycle and fatty acid metabolism components, including fatty acyl CoA synthesis and fatty acid beta-oxidation of tumor cells, was found in the first layer, when compared with those in outer areas from the tumor side。這可能表明，由于進一步侵襲需要額外的能量，第一層中的腫瘤細胞經歷了代謝重編程以上調脂質代謝。 正如預期的那樣，與腫瘤旁側的細胞（主要由肝細胞組成）相比，邊界線腫瘤側的腫瘤細胞表現出更高的 G2M 評分，表明腫瘤細胞具有更高的增殖能力。除了較高的增殖能力外，與邊界線旁瘤側的外部區域相比，在最接近的層中還檢測到更高的細胞凋亡水平，這可能反映了靠近腫瘤旁邊界線的肝細胞的嚴重受損狀態 . 對于腫瘤細胞，在最接近的層中凋亡水平較高，但從侵襲前沿的腫瘤側觀察到不同層的增殖能力沒有差異。在副腫瘤側的第一層也發現細胞（主要由肝細胞組成）中更高水平的缺氧、糖酵解、增殖能力和凋亡。 因此，我們將以邊界線為中心的 500 μm 寬區域定義為“侵入前沿”，這比之前定義的以邊界線為中心的 1,000 μm 寬區域更合理。 綜上所述，這些結果表明腫瘤細胞中脂肪酸代謝的能量供應增強，并且在靠近邊界的區域中發現了占主導地位的抑制性免疫環境，尤其是在侵襲前沿。

（4）The damaged states of hepatocytes at invasive fronts were related to the prognoses of patients with primary and metastatic liver cancers.

除了代謝重編程現象和腫瘤細胞在侵襲前沿的免疫逃逸特征增強外，侵襲前沿的細胞成分（主要由肝細胞組成）也表現出增殖能力增強和細胞凋亡增加。 一些研究報道了肝細胞的炎癥反應導致肝癌或肝轉移。 為了表征細胞成分的炎癥反應并在腫瘤侵襲期間識別不同的細胞簇，我們根據其在侵襲前沿的副腫瘤側的三層（0-750 μm 寬區域）中的基因表達譜重新聚集肝細胞。 我們根據不同的基因表達譜確定了兩種肝細胞亞型（Hep1 和 Hep2），其中 Hep1 細胞的 SAA1（急性期蛋白血清淀粉樣蛋白 A1）和 SAA2（血清淀粉樣蛋白 A2）的表達水平顯著高于 Hep2 細胞。

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• 注：Volcano plot showing differentially-expressed genes between Hep1 and Hep2. The red dots represent genes upregulated in Hep1 cells and the blue dots represent genes upregulated in Hep2 cells

關于它們的空間分布，Hep1 細胞主要聚集在第一層，靠近邊界線的寬度為 250 μm，揭示了肝細胞由于直接暴露于腫瘤侵襲而嚴重受損的狀態，這一點使用 IF 得到證實

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The bulk RNA-seq data from Validation Cohort 2 also showed much higher expression levels of SAA1 and SAA2 around the border areas (bilateral sampling of tissues with a width of 5 mm along the borderline) than corresponding tumor tissues and adjacent normal tissues。此外，來自另外 93 名 ICC 患者（驗證隊列 3）的 IHC 結果也顯示在侵襲性前沿的 SAA 表達高于腫瘤組織或鄰近正常組織外部區域的 SAA 表達

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使用基因富集分析，與 Hep2 細胞相比，在 Hep1 細胞中還鑒定了包括氧化磷酸化、MYC 靶向 V1 和上調基因的上皮間質轉化 (EMT) 在內的富集途徑。與 Hep2 細胞相比，單細胞調節網絡推理和聚類 (SCENIC) 分析還確定了不同的上調轉錄因子 (TF)，包括 Hep1 細胞中的 CEBPG、YY1、ETV6、CDX1 和 CTCFL

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在這些TF中，ETV6、CEBPG、YY1和BHLHE40在SCENIC中被注釋為SAA1和SAA2的潛在TF，表明靠近侵入前沿的第一層活動得分增加，這可能參與介導了SAA1的高表達 Hep1 細胞中的 SAA2

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• 注：The TF activity scores of ETV6, CEBPG, YY1, and BHLHE40 in hepatocytes at invasive fronts in ST sides (LC5-B).

另一方面，根據 scRNA-seq 數據，報道的 SAA 受體基因，包括 FPR1、FPR2、TLR4、TLR2、SCARB1 和 CD36，主要在巨噬細胞中富集，這也得到了 ST slides結果的證實。

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此外，表達編碼 SAA 受體基因的巨噬細胞斑點和 Hep1 細胞在侵襲前沿在空間上積累，進一步表明巨噬細胞在侵襲前沿從肝細胞分泌 SAA

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The accumulation of FPR1⁺ macrophages close to SAA⁺ hepatocytes at invasive fronts was further confirmed by multiplexed IF in Validation Cohort 1, including ICC (n = 10), HCC (n = 5), liver metastasis of colorectal cancer (n = 3), liver metastasis of pancreatic cancer (n = 2), and liver metastasis of lung cancer (n=1)

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具體而言，在包括 ICC 和 HCC 在內的原發性肝癌以及上述轉移性肝癌中，發現腫瘤側 FPR1⁺ 巨噬細胞數量顯著增加，侵襲前沿旁腫瘤側的 SAA⁺ 肝細胞數量顯著增加.

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還觀察到巨噬細胞富集與 SAA⁺ 肝細胞在侵襲前沿之間的強相關性（R = 0.73，P = 0.017）.此外，沿著正常腫瘤邊界的侵襲前沿也存在高度異質性。 我們發現靠近 SAA 富集區域的腫瘤細胞表現出增強的 EMT、上調能量代謝過程（ATP 代謝過程、氧化磷酸化和呼吸電子傳遞鏈）和激活的免疫反應（干擾素 α 反應和 IL2-STAT5 信號傳導） ) 與附近腫瘤細胞 Hep1 非富集 (Hep2 富集) 區域的侵襲性前沿相比.Finally, the damaged states of hepatocytes at invasive fronts were found to be related to the prognoses of patients with primary liver cancers. The higher expressions of SAA1 and SAA2 in the border areas from Validation Cohort 2 were significantly associated with worse overall survival (OS) of ICC patients (P = 0.019 for SAA1 and P = 0.019 for SAA2).IHC results from 93 ICC patients (Validation Cohort 3) also showed significant negative correlations between SAA expression levels at invasive fronts and the OS, as well as relapse-free survival (RFS) for ICC patients.這些結果表明肝細胞的受損狀態與腫瘤進展以及患者的預后有關。 最重要的是，我們確定了肝細胞的受損狀態，其特征在于響應于腫瘤侵襲的 SAA 過表達，隨后募集巨噬細胞以進一步侵襲腫瘤，最終導致更差的預后。

Discussion

在這項研究中，將亞細胞分辨率的空間分辨轉錄組學與 scRNA-seq 相結合，以繪制來自 8 名 ICC 患者的四個區域位點的轉錄結構圖。與其他 ST 方法相比，我們的 Stereo-seq 數據具有前所未有的納米級分辨率（220 nm × 220 nm/點）和可擴展區域（10 mm × 10 mm），能夠更準確地原位研究細胞類型或細胞狀態，并且空間分割和進一步分析的更多空間。在我們的研究中使用 Stereo-seq 能夠識別 ICC 患者不同區域的細胞類型和 ECM 成分分布。結果證實了細胞和ECM的組成異質性，以及它們在不同區域之間的空間分布。通過構建腫瘤邊緣區域周圍區域的分割模型，我們首先確定了侵襲前沿周圍區域（以邊界為中心的 500 μm 寬區域）中免疫細胞簇的獨特富集、腫瘤細胞的代謝重編程和肝細胞的炎癥狀態。 , 每邊 250 μm)。

腫瘤細胞侵入旁組織并直接接觸的侵襲前沿被認為是了解腫瘤進展和轉移所必需的實體瘤中最重要的區域。對這些區域的轉錄結構進行全面繪制有助于更好地了解分子病理學和個性化治療策略的開發，例如實體瘤的免疫檢查點阻斷療法。作為 TME 的一個基本生物學特征，由于研究工具的局限性，空間異質性在很大程度上被忽略了。在本研究中，基于使用立體序列的空間轉錄組學結構的綜合映射，將侵襲前沿的空間異質性與 ICC 中的其他區域進行了比較，這有助于了解腫瘤行為，包括侵襲和轉移。基于由 ST 載玻片邊界線兩側的三層組成的構建模型，發現在離腫瘤最近的 250 μm 寬的層中觀察到免疫細胞的富集和獨特的免疫抑制微環境和腫瘤細胞的代謝重編程邊界線的一側。在免疫細胞中，巨噬細胞主要由聚集在侵襲前沿的主要 M2 樣巨噬細胞組成，表明抗炎巨噬細胞對腫瘤進展的主要促進作用。此外，我們發現免疫檢查點基因的表達增強，包括免疫細胞中的 CTLA4，我們還發現最靠近邊界層的腫瘤細胞中的免疫逃避特征上調。因此，在侵襲前沿發現了更具抑制性的免疫微環境，這可以促進實體瘤的進一步腫瘤侵襲和轉移。

基于邊緣區域的精確分割，我們的研究還全面表征了腫瘤細胞在侵襲前沿的不同細胞狀態。通過分析與腫瘤細胞行為相關的常規途徑，我們觀察到更多來自脂肪酸代謝上調的能量供應成分，包括與腫瘤外層相比，腫瘤側最接近層的腫瘤細胞中脂肪酸合成和氧化增加 -副腫瘤邊界，進一步表明這些位置的腫瘤細胞經歷了增強脂肪酸代謝的明顯代謝重編程，以增加能量供應，以更好地促進腫瘤細胞侵襲。同時，我們還發現，與外部區域相比，離邊界線旁瘤側最近的層的細胞成分的缺氧狀態、糖酵解水平以及增殖能力和凋亡水平均有所增強。由于所有這些結果都揭示了侵襲前沿周圍區域的不同炎癥狀態和特殊代謝特征，我們將以腫瘤邊界為中心的 500 μm 寬區域重新定義為“侵襲前沿”，這比之前定義的 1,000 μm 寬區域更合理以邊界為中心。此外，為了增加能量供應，腫瘤細胞中增強的脂肪酸代謝的代謝重編程可以解釋實體瘤的進一步腫瘤侵襲。因此，阻斷這一過程的治療方法可能是一種抑制腫瘤侵襲和轉移的新療法。

通過進一步表征侵襲前沿細胞成分的特征，我們發現侵襲前沿的肝細胞也發生了明顯的炎癥變化，SAA及其TFs高表達，包括ETV6、CEBPG、YY1和BHLHE40，反映了肝細胞的受損狀況被腫瘤細胞侵入 45, 46。 SAA 可以直接協調先天免疫細胞的積累，如單核細胞、未成熟的 DC、中性粒細胞和 T 細胞。在侵襲前沿的巨噬細胞中檢測到 SAA 受體，包括 FPR1 和 FPR2，并在靠近 Hep1 細胞處顯著積累，這可能是由于受損的肝細胞分泌 SAA，在靠近邊界處募集巨噬細胞所致。這種可能性與一項研究一致，該研究報告肝細胞上調 SAA1 表達并為小鼠模型中胰腺癌的肝轉移提供了促轉移生態位 45。 SAA 在侵襲前沿的高表達和富集可以解釋該部位免疫細胞的聚集，這在其他研究以及我們自己的研究中都有報道。據報道，SAA 有助于 M2-巨噬細胞分化，這可以解釋在侵襲性前沿發現更多 M2 樣巨噬細胞的存在。此外，在其他實體瘤包括 HCC、結直腸癌肝轉移和胰腺癌的侵襲前沿也證實了 SAA 的高表達和巨噬細胞的積累，并進一步發現與患者較差的預后相關。我們的工作確定了軸向侵入前沿的異質性，腫瘤細胞狀態的高度變化和沿邊界的受損肝細胞分布。最重要的是，我們發現了SAA在侵襲前沿對肝細胞表達的新作用，它反映了肝細胞的受損狀態，并介導巨噬細胞（主要是M2樣巨噬細胞）的募集以進一步促進腫瘤進展.

盡管 Stero-seq 提供了高納米級分辨率（220 nm × 220 nm/點）來捕獲每個細胞幾百個點的轉錄物，但仍然難以識別細胞邊界并在單個細胞水平上捕獲準確的轉錄物。 在我們的研究中，納米級分辨率的原始空間表達矩陣被轉換為 25 μm 平方大小（50 × 50 bins/pseudo-spot）的細胞大小的偽點，并以最高概率分配給特定的細胞類型。 因此，由于技術限制，仍然難以在空間上繪制解析的單細胞遺傳信息并精確推斷細胞類型

總之，本研究表征了腫瘤生態系統的復雜性和異質性，以及 ICC 不同區域位點的細胞相互作用，確定了免疫細胞浸潤、抑制性免疫微環境、腫瘤細胞的代謝重編程以及在侵襲前沿富集的受損肝細胞。 . 我們還在 HCC、結直腸癌或胰腺癌的肝轉移中驗證了這一發現。 總體而言，該結果提供了對腫瘤侵襲前沿存在的異質性的全面理解和詳細表征，這將有助于開發更精確和有效的治療實體瘤的治療靶點。

Method(我們來關注一下分析的方法)

聚類

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空間注釋

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很有想法的文章，值得借鑒，尤其是空間細胞密度的分析和通路開關

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