最近我們連續解讀了3篇P53在CRISPR-Cas9基因編輯過程中的影響，目前第4篇還在撰寫中。為了調劑一下文獻閱讀的凝重感，今天咱們更點短小精悍的。在我們之前的推文中提到過，桑格測序是CRISPR-Cas9基因編輯結果的金標準。一般我們先將多個單克隆細胞的PCR產物送測序，選擇擁有套峰的單克隆細胞進行T載體連接測序，用以檢驗最終的基因型。關于如何解讀桑格測序封圖，可以參考測序公司給的文檔，感興趣也可以點擊我們之前的文章：看不懂測序峰圖就好像有答案都不會抄

如何判斷CRISPR編輯成功，怎么拆套峰?

該怎么送樣本，送什么樣本進行sanger測序？什么樣的sanger測序結果才是基因編輯成功的樣子？這是一個比較高頻率的問題。同時我們在峰圖解析的文章中提到過手動拆套峰，因此如何拆套峰，也常被問到。

question

1. 該送什么樣本

在獲取單細胞克隆并將將細胞擴增后，一般我們會按照以下順序準備兩種樣本：

（1）提取上述細胞的基因組DNA，由高保真DNA聚合酶擴增的，含有gRNA ontarget位點的DNA片段。強調一定要是高保真酶P出來的序列，我們通過觀察PCR產物峰圖來挑選進一步驗證的單細胞克隆。

（2）將該DNA片段通過解鏈，與T載體連接并轉化后，挑取的單菌落搖起來的菌液。

加送PCR所用的引物，選擇單邊用于sanger測序，原因：

（1）省錢：無需公司額外合成引物；

（2）不用公司通用引物：因為自連的T載體在通用引物下也能被測出來，只要測出來就收費。使用PCR所用的引物，可以精準跟蹤目的基因的基因型變化，既省錢又免去在查閱自連載體測序結果上的時間。

2. CRISPR-Cas9基因編輯結果可能出現的峰圖

我們以依賴NHEJ修復的CRISPR-Cas9基因敲除為例，可能出現的峰圖如下圖：

peaks

依據PCR產物峰圖結果，我目前的工作流程如下：

workflow

3. 為什么要手動拆峰？

我們需要最終的基因型sanger測序結果，用于文章發表。在一切順利的情況下，其實不花多少時間。但如果T載體連接失敗或者總是只測到單邊序列，急于知道基因編輯結果時，可以選擇手動拆峰。

我目前的手動拆峰方法是來自于DZ師兄的言傳身教，如果大家有什么新的方法，可以在評論中指出，感謝~我們的手動拆峰方法要求一定要有以下兩個結果：

（1）PCR sanger測序結果：通過實驗獲得

（2）其中一條鏈的序列：通過實驗獲得，或者通過工具獲得。

4. Poly Peak Parser：拆峰工具

如果已有實驗結果獲得了其中一條鏈的序列，我們可以直接手動拆峰。當T載連接實驗總是失敗時，我們也可以依據PCR產物sanger測序峰圖，使用網頁Poly Peak Parser推導其中一條鏈的序列。該網頁工具的界面和使用方法都非常簡單，在推薦給大家之前，我使用自己的測序結果驗證過，目前沒發現有錯的結果，可以十分精準的推測出二倍體細胞在基因編輯后的其中一條鏈的序列。

Poly Peak Parser

5. 手動拆峰

工作思路如下：

（1）PCR序列：讀取PCR測序結果的上峰圖為PCR序列1，將套峰下峰的序列讀出為PCR序列2

（2）T vector測到的/軟件分析出的其中一條鏈的序列，我們先稱之為T序列：摘取T序列和PCR序列1,2進行比對，摘取的位置從gRNA位點前（雙峰出現前5-10個堿基）開始，一直到T序列突變位置結束后5-10個序列。通過同位點的上下替換，使得其中一條PCR序列和T序列一致，則剩下的PCR序列則為另外一條鏈的序列結果。

用文字描述非常難以理解，我們用過實際樣本進行進行推測吧。

example

將PCR上峰和下峰序列讀出

我們在雙峰出現位點前幾個堿基開始讀取序列（圖中藍色選取部分）如下：

拆峰

將T載體序列和PCR上峰，PCR下峰序列抄下來比對。通過同位點堿基替換使得PCR下峰序列和T在序列一致，經替換后的PCR上峰序列，則為另外一條鏈的結果。將該序列保存為DNA序列，加入到軟件中比對可看到，另外一條鏈的基因編輯結果為一個A堿基的插入。結合兩條鏈的結果，都沒有出現3的倍數的堿基缺失或插入，初步認定該細胞為成功的敲除細胞系。

final result

以上拆峰適用于二倍體的單細胞克隆細胞系。如果發現拆峰結果不匹配或者拆峰無法順利進行（上下沒有可替換的堿基），則說明該細胞可能為多倍體或者多克隆細胞系。

小結

拆峰是個手藝活，需要用眼睛慢慢看，過程可能枯燥乏味，但對trouble shooting很有幫助。同時對急于需要知道細胞基因型，才能進行下一步的實驗，有這么一手還是很舒心滴！最后，歡迎小伙伴們提出自己寶貴的經驗，幫助我進一步學習，感謝~

部分前期文章：

1. 我們用兩篇文章的篇幅大概講了一遍質粒骨架及其各個要素的介紹：
   解剖式學習一個質粒結構--update
   質粒系列之什么是質粒
2. 再談了最傳統的限制性克隆：
   質粒系列之限制性克隆--restriction cloning
3. 前面還夾雜的講過一些piggybac、gateway、RMCE的一些內容：
   基因編輯如何換藥不換湯
4. 慢病毒系列也有講過兩篇：
   團隊作案HEK293，史上最強搬磚細胞
   不想再用慢病毒了，我還有什么別的選擇嗎？piggyBac transposon
5. 此外我們本還有一個CRISPR screening的專題，只有開頭，未得完善：精準大海撈針--5. CRISPR screening專題
6. 質粒系列之再談無縫連接--Gibson assembly
7. Golden Gate，質粒改造的王者
8. 關于CRISPR-Cas9技術的脫靶效應：CRISPR-Cas9基因編輯--脫靶效應如何檢測
9. CRISPR和TP53文獻解讀之：Cas9誘導P53激活并導致細胞死亡
10. CRISPR和TP53文獻解讀之：Cas9活性可篩選P53突變細胞
11. 怎么肥事：P53你竟然不讓我HDR精準修復！