我們最近都在聊CRISPR-Cas9技術(shù)和TP53的關(guān)系，最近聊的兩篇文章內(nèi)容可以簡述為：（1）CRISPR-Cas9誘導(dǎo)DSB，DSB激活P53，導(dǎo)致細(xì)胞死亡；（2）CRISPR-Cas9無法使得P53 mutant細(xì)胞死亡，從而富集P53突變細(xì)胞。那么CRISPR-Cas9是依賴DNA修復(fù)的技術(shù)，TP53是DNA修復(fù)的上游信號(hào)，是否CRISPR-Cas9對DNA修復(fù)功能也有影響呢？這一次，我們將解讀一篇關(guān)于CRISPR-Cas9技術(shù)應(yīng)用中，P53狀態(tài)和DNA修復(fù)之間的關(guān)系。目前的思路圖如下：
文獻(xiàn)解讀：CRISPR-Cas9在不同狀態(tài)P53細(xì)胞中的DNA損傷修復(fù)情況
選文：今天挑的文章和我們講的paper 1是同一天發(fā)表在Nature Medicine雜志上的。paper 1（下圖上）作為letter形式發(fā)表而今天的文章是一個(gè)brief communication（下圖下）。
1. 研究背景和問題
Cas9誘導(dǎo)的DNA雙鏈斷裂（DSBs）可通過非同源端連接（NHEJ）或同源重組（HDR）進(jìn)行修復(fù)。修復(fù)機(jī)制的選擇取決于細(xì)胞周期的不同階段，在G1時(shí)NHEJ占主導(dǎo)地位（NHEJ在整個(gè)細(xì)胞周期中都有），而在DNA復(fù)制時(shí)HDR開始有效。這就導(dǎo)致依賴HDR修復(fù)機(jī)制的精準(zhǔn)基因編輯效率低于NHEJ機(jī)制，這對于大部分腫瘤細(xì)胞來說HDR效率稍微低一點(diǎn)沒什么，因其本身效率就很高。但對于正常細(xì)胞系，尤其是干細(xì)胞等，其HDR精準(zhǔn)編輯難度非常大。雖然近年來已可通過（1）提高修復(fù)DNA模板濃度，（2）添加NHEJ抑制劑以及（3）優(yōu)化轉(zhuǎn)染等方式增加精準(zhǔn)編輯效率。然<u>而對于正常的、未轉(zhuǎn)化的人類細(xì)胞的低精準(zhǔn)編輯效率，其機(jī)制仍然未知。</u>
2. 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果
2.1 經(jīng)典CRISRP文庫篩選：dropout screens
<u>方法介紹：</u>下圖a是一個(gè)經(jīng)典的CRISPR文庫篩選策略。選一定數(shù)量的細(xì)胞，轉(zhuǎn)導(dǎo)CRISPR慢病毒文庫并經(jīng)抗生素篩選后將細(xì)胞分成兩份，一份是initial sample（初始樣本），一份是終止樣本（細(xì)胞培養(yǎng)一定時(shí)間后/或經(jīng)過實(shí)驗(yàn)處理）。通過比對初始樣本和終止樣本的sgRNA文庫：（1）某些sgRNA已不再被檢測到或者含量非常低，則可說明這些sgRNA編輯的基因是生長必須的基因；（2）某些sgRNA含量 比例增加，則一方面可能是其他sgRNA量的減少，導(dǎo)致這部分細(xì)胞比例增加，也有可能是這些sgRNA對調(diào)控細(xì)胞生長的基因進(jìn)行了敲除或者抑制。
結(jié)果：
如下左圖b：作者選用永生化的視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞 （retinal pigment epithelium，RPE）進(jìn)行CRISPR文庫篩選：部分細(xì)胞在被敲除生長必須基因后應(yīng)該死亡，則針對這些基因的sgRNA不應(yīng)被檢測到，而他們檢測到了。對sgRNA進(jìn)行統(tǒng)計(jì)后發(fā)現(xiàn)P53-P21-RB1等基因的sgRNA序列高度富集。因此<u>作者推測是P53-P21-RB1軸的失常，導(dǎo)致細(xì)胞在被敲除生長必須基因后仍能存活。</u>
如下右圖c：為驗(yàn)證P53-P21RB1軸失常對維持細(xì)胞生存的作用，作者對RPE P53+/+和P53-/-細(xì)胞進(jìn)行全基因組CRISPR文庫篩選，將對細(xì)胞生長必須的核糖體基因進(jìn)行分析：（1）P53-/- RPE 有相當(dāng)一部分細(xì)胞的核糖體基因含量很少，說明在沒有正常核糖體基因的情況下仍能存活。（2）而P53+/+ RPE細(xì)胞都有較高含量的核糖體基因，說明被敲除核糖體基因的細(xì)胞已經(jīng)死亡。總得來說，在該死的時(shí)候，p53-/-細(xì)胞不死。經(jīng)過前面兩篇文章的解說，<u>我們很容易認(rèn)為這是由于P53缺失，導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)失敗造成的，但是不是呢</u>？
解讀分析：在正文中有很短的一段話銜接，雖然結(jié)果在中文和補(bǔ)充材料中我都沒找到。作者發(fā)現(xiàn)P21 sgRNA的富集僅僅出現(xiàn)在P53+/+中，在P53-/-則無P21 sgRNA富集。因此作者認(rèn)為，P21的缺失僅僅在P53+/+的時(shí)候，才能給細(xì)胞提供生長競爭優(yōu)勢。由于P21是P53調(diào)節(jié)細(xì)胞周期的重要下游因子，因此作者假設(shè)，CRISPR-Cas9誘導(dǎo)DSBs觸發(fā)了通過p21和pRB介導(dǎo)的短暫的、p53依賴的細(xì)胞周期阻滯，而與靶向位點(diǎn)無關(guān)。注意這里提到了與靶點(diǎn)無關(guān)，即<u>只要達(dá)到細(xì)胞周期阻滯效果皆可，不一定是P53缺失</u>。這里就為后面的研究做了前因后果鋪墊，這也是本文與同一天發(fā)表的另外一篇文章的不同之處。
2.2 P53狀態(tài)對細(xì)胞周期的影響
方法介紹：
（1）上文提到短暫的細(xì)胞周期阻滯，因此作者選用了瞬轉(zhuǎn)的CRISPR-Cas9方法：即直接將Cas9蛋白和sgRNA的復(fù)合物投放到細(xì)胞中，這個(gè)復(fù)合物叫做核糖核蛋白（ribonucleoprotein，RNP）。
（2）此外，還設(shè)計(jì)依賴HDR的CRISPR-Cas9精準(zhǔn)修復(fù)實(shí)驗(yàn)BFP-GFP實(shí)驗(yàn)，如下圖b所示：細(xì)胞原本帶有mutant GFP-2A-BFP元件，由于GFP是突變的無法發(fā)光，因此細(xì)胞只表達(dá)藍(lán)色熒光，通過HDR精準(zhǔn)修復(fù)mutant-GFP后，被修復(fù)的細(xì)胞同時(shí)發(fā)藍(lán)色和綠色熒光。
解讀分析：從上圖a結(jié)果可看到，經(jīng)由RNP瞬時(shí)CRISPR-Cas9基因編輯時(shí)，P53-/-細(xì)胞其周期沒有特別改變，而p53+/+細(xì)胞則出現(xiàn)G1期增加（NHEJ增強(qiáng)），G2/S期減少的情況（HDR減弱）。
2.3 細(xì)胞周期與HDR精準(zhǔn)編輯的關(guān)系
鑒于HDR主要在S期中激活，作者認(rèn)為P53WT細(xì)胞的由于P53激活導(dǎo)致G2/S期細(xì)胞減少，從而依賴HDR 的CRISPR-Cas9精準(zhǔn)編輯效率不如p53-/-細(xì)胞。為了驗(yàn)證這個(gè)假設(shè)，使用了上圖b中的BFG-GFP實(shí)驗(yàn)。從下圖結(jié)果可看到，確實(shí)p53-/-組的綠色熒光細(xì)胞更多，證明p53-/-的精準(zhǔn)編輯更多。
同時(shí)作者使用細(xì)胞周期抑制劑--CDK4/6抑制劑palbociclib，將細(xì)胞周期阻滯在G1期，此時(shí)G2/S期細(xì)胞會(huì)變少，可以看到HDR精準(zhǔn)編輯的效率下降。這一個(gè)實(shí)驗(yàn)非常重要，因?yàn)镻53+/+細(xì)胞的低編輯效率也可以是因?yàn)榧?xì)胞的死亡，就如前面paper1我們提到的那樣，<u>這里使用細(xì)胞周期抑制劑，使得兩者的相關(guān)關(guān)系，進(jìn)一步往因果關(guān)系靠攏。</u>
2.4 驗(yàn)證性實(shí)驗(yàn)：P53激活劑和抑制劑
接下來是兩個(gè)在P53研究中非常常用的抑制劑和激活劑。
P53抑制劑MDM2：如下圖e，P53在常規(guī)情況下被MDM2泛素化，最后被運(yùn)送到蛋白酶體降解，這就是P53在正常細(xì)胞中維持非常低水平的原因。而外加MDM2則可降低Cas9誘導(dǎo)DSB時(shí)誘導(dǎo)的P53水平，使得HDR精準(zhǔn)修復(fù)效率更高。
P53激活劑Nutin3a：如下圖f，Nutin3a通過抑制MDM2作用，使得P53不再被泛素化，P53蛋白得以穩(wěn)定于細(xì)胞中，此時(shí)HDR精準(zhǔn)編輯效率降低。這部分的結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)P53與HDR精準(zhǔn)編輯的關(guān)系。如果可以的話，最好把細(xì)胞周期結(jié)果補(bǔ)一補(bǔ)，進(jìn)一步驗(yàn)證“P53-細(xì)胞周期阻滯-HDR精準(zhǔn)修復(fù)效率”這個(gè)機(jī)制。
綜上所述，P53激活導(dǎo)致的細(xì)胞周期阻滯會(huì)降低HDR精準(zhǔn)編輯效率，而抑制P53可以增加精準(zhǔn)編輯的效率。
3. 未解決問題
即使短暫的P53抑制都有可能會(huì)導(dǎo)致染色質(zhì)重排或者基因損傷修復(fù)失敗，從而積累DNA突變，對后續(xù)應(yīng)用造成影響，因此需要進(jìn)一步的工作去驗(yàn)證短時(shí)P53抑制對細(xì)胞的影響。在這里不得不佩服大課題組的敏銳嗅覺，這篇文章發(fā)表于2018年6月份，就在2019年就已有關(guān)于瞬時(shí)抑制P53對細(xì)胞基因組或功能影響的研究，且該文發(fā)表在干細(xì)胞領(lǐng)域top期刊cell stem cell上，下次我們將來解讀，別人是如何解決這個(gè)問題的。
結(jié)語
別看這篇文章只是brief communication，文章篇幅雖短，但是實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)十分精巧。尤其是如何擺脫P(yáng)53和凋亡之間的關(guān)系，轉(zhuǎn)而研究細(xì)胞周期這部分，做了很好的銜接。早在2019年我也讀過這篇文章，從前讀文章只會(huì)看結(jié)果，讓自己強(qiáng)行接受作者的觀點(diǎn)。而這次有了前面幾篇文章的鋪墊，我開始會(huì)橫向比較這些工作的不同，以及他們?nèi)绾未_定自己的方向。白天太忙有時(shí)候無法思考，到了晚上躺在床上拿出手機(jī)細(xì)細(xì)的看，寫寫筆記，越看越對頭。最近已經(jīng)愛上了這樣的文獻(xiàn)閱讀方式，假以時(shí)日，我們期盼能把P53和CRISRP-Cas9之間的經(jīng)典文章都過一遍，組成自己的小宇宙。同時(shí)在文末不斷的強(qiáng)調(diào)這是學(xué)習(xí)筆記，希望大家多多反饋交流。也在這里像廣大小伙伴發(fā)出邀請，如果您也想一起看文章，請?jiān)谠u(píng)論摳1，但最終還是要圍繞自己的可以讀文，還是有個(gè)輕重緩急。
我們最終的目的還是：一起學(xué)習(xí)！
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