限制性內切酶分類繁多，根據切割位點類型分為3類 ，切得老遠老遠的是I型；切割識別位點外25個bp左右的是III型；切割識別別位點及其附近的是II型。II型還有特定的亞型，包含IIS類，切割識別位點之外5-6個剪輯對的序列，簡略比較圖如下：

compare

上圖我將II型默認為我們常規用到的Ⅱ型酶（IIP型），由于II型酶還有各類亞型，為了方便后續學習，我們先簡單了解一下II型酶家族都有哪些分類以及特征。

1. II型限制性內切酶家族

數量：II型限制性內切酶是日常分子生物學中最常見的酶，如基因克隆和DNA片段分析。目前已發現超過3500種II型酶，可識別超過350種DNA序列。通過對細菌和古細菌基因組的分析，已確定了數千種II型酶，但其特征仍未確定。

命名：限制性內切酶依據發現它們的微生物命名。例如，HindIII叫Hin d three是在流感嗜血桿菌（<u>H</u>aemophilus influenzae）<u>d</u>血清型中發現的第<u>3</u>種內切酶，由此可第二種和第一種則分明名為HindI、HindII。有時添加前綴r以區分限制性內切酶與它們細胞內的修飾酶。因此，R.HindIII專指限制性內切酶，M.HindIII專指修飾酶。當無歧義時，前綴r被省略。

Hind3

常規亞分類： Type IIP, IIS, IIC, and IIT。II型酶分類有多達十幾種，有機會的話我們可以詳細討論各種亞分類的不同結構以及為何會產生不同的切割結果（挖坑），想要自行學習的小伙伴可在文末查看我們推薦的文獻。下面我們簡單介紹一下常規使用的幾種II酶亞類的區別。

大家一定好奇，II后面的字母是如何來的呢？

(1) IIP（<u>P</u>alindromic）：IIP型是最重要的亞型，占分子生物學中酶的90%以上 ，識別長度為4到8個堿基對的回文序列，切割位點也通常在該序列內 。大多數IIP型酶識別特異的DNA序列，每個位置只能有一個特定的堿基對(例如BglII: AGATCT)，但一些IIP型酶可識別簡并（模糊）序列，其中可以有不同的堿基對。

(2) IIS（<u>S</u>hifted cleavage）：IIS型酶在識別序列之外的固定位置切割DNA。裂解點移（shift）到序列的一側。IIS就是GG克隆使用到的酶類。

(3) IIC（<u>C</u>ombined）：同時具有內切酶和甲基轉移酶活性。限制性內切酶大部分是由細菌和古菌產生的，其對宿主細胞具有潛在毒性，而對限制性內切酶的保護性解毒劑會以DNA甲基轉移酶的形式產生。這種酶識別與限制性內切酶相同的序列，通過化學方法改變細胞自身DNA的每個位點，防止其被裂解。而這種DNA修飾包括甲基化，可通過形成空間位阻，阻止限制性內切酶與該位點結合。IIC型酶可以同時催化兩種相互競爭的反應：酶切和甲基化。甲基轉移酶反應普遍需要輔助因子s -腺苷蛋氨酸(SAM)。有些IIC型酶在裂解時也需要SAM，有些僅僅受到SAM的刺激，還有一些根本不需要SAM。如果存在SAM，甲基化會隨著裂解而進行，從而阻止完全消化。IIC型酶在分子生物學中應用不多，所以我也并未用過這種酶。

(4) IIT（<u>T</u>wo different subunits or <u>T</u>wo different catalytic ）：異源二聚體限制性內切酶，包含兩個不同的亞基，或具有兩個不同的催化位點。

2. Golden Gate克隆特性

通過以上描述，我們得到的最直觀信息是：（1）IIS型裂解識別序列外的序列；（2）IIS型為無痕連接。因而可以推測GG克隆的特性：

（1）切割識別序列外序列， 則說明切割位點并不特異，任意序列只要在這附近有特異性的IIS型酶識別位點即可，這就提供了酶切的無限可能！

（2）無痕連接：切割后若為自連，則IIS酶會不斷酶切自連位置，因此自連產物幾乎不太可能會被轉化進感受態細胞（只有酶切不完全的情況下，會有原始質粒被轉入感受態的可能）；切割后若連接成功則丟失酶切位點，因而只要連接，即是成功?；谶@個特性，酶切和連接可以在同一試管內完成，無需酶切回收片段后再連接，該效率堪比Gibson assembly。

BbsI

（3）速度快、效率高：由于切割和連接可在同一管內完成且效率幾近100%，因此反應在半小時內即可完成。

（4）多片段可同時組裝，只要插入片段兩端酶切位點設計得當，即可同時連接多達10個以上片段。

Golden Gate克隆示意圖

下圖描述了兩種常用的插入片段制備辦法，無論是酶切還是PCR，其根本還是要產生互補的粘性末端，因此只要粘性末端設計得當，可同時插入多種片段。具體的方法可參考2020年新發表的文章：Synthetic DNA Assembly Using Golden Gate Cloning and the Hierarchical Modular Cloning Pipeline，具體信息在文末給出。該文描述了5種basic protocol，并給出了案例分析以及實驗條件，由于本文篇幅有限，則不再展開該文，但非常值得一讀。

basic protocol

3. 案例學習

在我們前面CRISPR-Csa9實驗記錄系列推文中，將sgRNA插入到Cas9質粒這個步驟使用的就是GG克隆的方法。接下來我們仍以這個克隆為例，分析實驗設計方案以及實驗條件調整用意。

3.1 準備gRNA oligo片段，一般使用梯度退火即可達到互補配對的效果

原設計匯總sgRNA的獲取是通過PCR擴增的，PCR產生的線狀DNA產物需要通過T4 PNK進行磷酸化，以提高后續連接效率。而我們的方案中由于使用的載體是 pSpCas9(BB)-2A-GFP，載體經過改進，BbsI兩位點在U6啟動子后面，gRNA scaffold前面，因此只需要將那20 nt長度的gRNA序列插入即可。而這gRNA序列是公司合成的，無須再進行磷酸化。

step1

3.2 使用Golden Gate克隆將gRNA片段插入

經過調整，將T7連接酶改為T4連接酶，而T4連接酶的緩沖液已經帶有DTT、ATP等成分，無須另外添加。雖然我們總是說GG克隆可以在30分鐘內完成反應，但在這個實驗中我們使用的是37℃與25℃交替反應6個循環，即為酶切-連接進行6個循環。在酶切-連接6個循環結束后，添加一個37℃ 30 min的步驟用于酶切未完全酶切的載體質粒，以減少感受態轉化后的自連克隆。同時添加65℃ 5 min步驟用于失活BbsI和T4連接酶，以免對感受態細胞造成傷害。

step2

4. Golden Gate應用

4.1 合成生物學

合成生物學家已經開發出一種模塊化克隆策略MoClo，它使用IIS型限制性內切酶BsaI和BpiI/BbsI一次有效地組裝多達6個DNA片段。這種方法利用IIS型酶在識別位點外切割的能力，并允許具有兼容懸端的DNA片段被有效組裝。
通過設計出獨特的酶識別位點，使DNA模塊的側翼呈反向方向，這樣多個DNA組分就可以在一個單一反應中定向組裝，而在兩者之間只保留一個確定的4bp融合位點。

MoClo系統由三組克隆載體（Level 0, Level 1, Level 2）組成，可以在三個連續的組裝步驟中使用。
（1）在開始之前，將包含基本部分（啟動子、utr、編碼序列、終止子等）的DNA片段插入到單個的level 0質粒中；

（2）在第一步組裝中，兼容的level 0被定向組裝成level，創建一個轉錄單元（例如:啟動子、5 UTR、編碼區域和終止子）。
（3）接下來，多達6個level 1模塊可以類似地組裝成level 2，從而形成一個基因結構。
在最后的組裝步驟中結合多個2級載體可以創建更復雜的結構。

MoClo

4.2 基因工程

就如我們上面舉的案例一樣，在CRISPR-Cas9基因編輯技術中，我們用到GG克隆將gRNA有效的插入到Cas9質粒中。此外基于GG克隆強大的DNA片段組裝能力，可使用GG克隆高效組裝TALEN以及TAL序列，從而參與基因編輯工作。具體信息可以查看我們文末提到的參考資料。其實只要是用到質粒改造的領域，GG克隆都有可能參與。因此無所謂它到底應用在哪兒了。

5. 結語

GG克隆雖然有效率高、速度快且操作簡單的優點。從多組分組裝來說，Gibson assembly仍相當具有競爭力。同傳統限制性克隆一樣，插入片段中如若含相同的IIS型酶切位點，會造成額外的酶切，因此IIS酶的酶切只能存在對的位置。而如果插入片段中含有同樣的識別位點，可通過PCR對該片段進行點突變沉默。而如果插入片段的相同IIS酶切位點太多無法完成突變時，可考慮使用Gateway克隆。我們之后也會單獨寫一篇Gateway克隆（繼續挖坑）。

對于非合成生物學、基因工程領域的我們，平時用到GG克隆的情況不多。首先IIS型酶種類并不算特別多，目前NEB上約有50種；其次與傳統限制性克隆一樣，GG克隆仍然依賴酶切識別位點；載體或者插入片段同時擁有合適酶切位點的情況不多見，還需要通過PCR對插入片段額外引入粘性末端，這個操作過程與Gibson assembly差不多一致，因此大多數情況大家還是會選擇Gibson assembly。然而Gibson assembly依賴可同源重組的粘性末端，當載體中具有相似同源片段時會有錯配的可能，此時可考慮使用GG克隆。

今天就到此為止，謝謝大家。