隨著測序技術(shù)的發(fā)展及新的組裝工具的不斷開發(fā)應(yīng)用，基因組denovo測序及組裝進入了Genomic2.0時代，我認為Genomic2.0時代的標志有兩點：1. 三代長讀長測序及Hi-C測序技術(shù)在基因組denovo測序上的用；2.組裝方法上，Canu和Hifisam等工具不斷被開發(fā)應(yīng)用出來，有的工具極大的降低了算力要求，有的工具能夠?qū)⒒蚪M組裝到單體型水平，也就是將同源或非同源的兩套多套染色體分別組裝出來，因此，最近幾年，不僅很多物種的基因組被公布，而早些年間即使被公布了的基因組，也都利用新的測序及組裝策略進行了更新。今天我先學(xué)習(xí)Hifiasm工具。
一.Hifiasm工具簡介:
Hifiasm是哈佛大學(xué)李恒團隊提出的一種全新的單倍體基因組組裝算法, 2021年2月份發(fā)表在Nature Methods上[ref1]。它可以多線程運行，對計算資源消耗教少，組裝快，結(jié)果準確性和連續(xù)性較高。Hifiasm (Hi-C) 針對PacBio HiFi (High-Fidelity) 長讀長測序技術(shù)和Hi-C (High-Throughput Chromatin Confirmation Capture) 測序技術(shù)進行了全新的設(shè)計。該算法結(jié)合了HiFi數(shù)據(jù)中精確的局部單倍型信息和Hi-C數(shù)據(jù)中的長距離互作用信息以達到全局定相 (phasing)，從而獲得不依賴親本信息的染色體級別的單倍型組裝結(jié)果。為了進一步提高組裝質(zhì)量，作者充分利用了組裝圖中的結(jié)構(gòu)信息，以及其前期研究中的Graph-binning等策略。
二．算法簡介
Hifiasm組裝主要分為三步。
Step1: 測序錯誤堿基糾錯
盡管Hifi reads準確性已經(jīng)很高了，但仍然會有部分測序(<1%)錯誤，Hifiasm會先通過所有序列的相互比對(all vs all)，對測序錯誤進行糾正。在比對中，基于reads間的overlap關(guān)系，如果同一個位置的reads出現(xiàn)兩種堿基類型，且每個堿基類型至少有3條reads支持，那么這個位置會被當作雜合位點，即一個SNP被保留，否則，視作測序錯誤，將被糾正（默認三輪糾錯）。值得注意的是，Hifiasm只使用相同單倍型的數(shù)據(jù)進行糾錯，從而避免過度校正，保留來自不同單倍型的雜合變異信息。在這一步，Hifiasm可以對雜合SNP進行定相（phasing）。
Step2: 構(gòu)建分型字符串圖（phased string graph）
根據(jù)序列之間的重疊關(guān)系，構(gòu)建分型字符串圖string-graph。Hifiasm以reads作為頂點，一致的overlap重疊區(qū)域作為邊，保留全部的氣泡(bubble)即保留了所有的雜合位點（圖1），因而可以保留下來基因組上全部的單倍型信息，以便后續(xù)對于單倍型的處理。
? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 圖1. Hifiasm組裝算法示意圖
Step3: 單倍體分型組裝
如果沒有額外的信息，Hifiasm在輸出序列時會任意選擇氣泡的一側(cè)構(gòu)建初級組裝，刪除多余的單倍體，輸出結(jié)果類似Falcon unzip和HiCanu的主要組裝結(jié)果（primary contigs）。優(yōu)于HiCanu需要依賴第三方工具去除dups序列，Hifiasm內(nèi)部實現(xiàn)了去除dups的算法優(yōu)化，簡化了流程。如果有來自父母本的測序數(shù)據(jù)，Hifiasam可以利用親本特有的Kmer在圖上識別出了父母本的序列，從而得到來自父母本的單倍體基因組序列。
在基于父母本特有Kmer時，區(qū)別于TrioCanu軟件的trio-binning策略，先將三代reads區(qū)分為來自父本、母本以及部分無法區(qū)分的reads后對區(qū)分后的reads分別組裝獲得了子代的兩套單倍體序列，Hifiasm使用了graph-binning的策略對此進行了改進。它不預(yù)先劃分reads，而是在string-graph中對reads進行標記。因此在一個較長的bubble中，即使只有一小部分reads被正確標記，hifiasm也可以正確地將其定相。通過這種方式，可以避免因為reads劃分錯誤而引入的錯誤位點和組裝斷裂，從而獲得更完整和更準確的單倍體組裝結(jié)果[ref2]。
三．軟件使用
1.軟件及測試數(shù)據(jù)下載
Github鏈接：https://github.com/chhylp123/hifiasm；
下載后make編譯；
下載測試數(shù)據(jù)：
wget https://github.com/chhylp123/hifiasm/releases/download/v0.7/chr11-2M.fa.gz
2.運行程序；
hifiasm使用時根據(jù)已有的數(shù)據(jù)分為三種模式: 2.1.只有HiFi數(shù)據(jù)(基本)模式； 2.2.有Hi-C數(shù)據(jù)的Hi-C模式；2.3.有雙親二代測序的Trio-binning模式。
2.1# Run on test data，基本模式,
./hifiasm -o test -t4 -f0 chr11-2M.fa.gz 2> test.log
awk '/^S/{print ">"$2;print $3}' test.bp.p_ctg.gfa > test.p_ctg.fa? # get primary contigs in FASTA
參數(shù)解釋：-o 輸出文件前綴， -f0 小數(shù)據(jù)使用，-t 線程數(shù)
awk提取主要的contig,這句話意思是對S開頭行處理，提取序列名稱$2和序列$3,獲得超長的contig序列；
可選參數(shù)--primary: 不組裝分型,只有primary和alternate的組裝結(jié)果
運行完成后需要關(guān)注的結(jié)果?(prefix表示前綴）：
test.bp.hap1.p_ctg.gfa: haplotype1的部分分型的contig graph;
test.bp.hap2.p_ctg.gfa: haplotype2的部分分型的contig graph;
test.bp.p_ctg.gfa (Primary assembly contig graph):主要contig的assembly graph, 對于低雜合度物種來說，優(yōu)先選擇該文件；對于高雜合度物種，該結(jié)果代表其中一個單倍型；
test.bp.p_utg.gfa(Haplotype-resolved processed unitig graph without small bubbles): 無小氣泡的單倍型解析, 在raw unitig graph基礎(chǔ)上過濾小的bubble，去掉由于體細胞突變和數(shù)據(jù)背景噪音引起的small bubbles（這個并不是真正的單體型信息），對于高度雜合基因組物種優(yōu)先選擇這個結(jié)果;
test.bp.r_utg.gfa(haplotype-resolved raw unitig graph in GFA format): 保留了所有的單倍型信息，包括體細胞突變和重復(fù)測序錯誤；
*.bin文件：運行時的糾錯和相互比對的結(jié)果；
其它結(jié)果：有的網(wǎng)友還提到了一個結(jié)果，我這次沒有生成：
prefix.a_ctg.gfa(Alternate assembly contig graph)：組裝出來的另一套單體型基因組結(jié)果。
對于2.2.有Hi-C數(shù)據(jù)的Hi-C模式；2.3.有雙親二代測序的Trio-binning模式，過段時間我再跑。
四.日志信息及參數(shù)調(diào)整
通常使用默認參數(shù)就可以，要根據(jù)日志信息判斷是否需要進行參數(shù)調(diào)整，最主要的日志信息是Kmer圖，從而判斷hifiasm是否能夠正確的找到純合峰，雜合峰的所在位置。如果hifiasm沒有找對純合峰所在的位置，會導(dǎo)致基因組大小不符合預(yù)期，
對于雜合率高的樣本，一個常見的問題是分型的結(jié)果兩套基因組差別較大，需要為-s設(shè)置更小的值(默認值:0.55)。
還有其它參數(shù)引用ref3，xuzhougeng的分享:
如果序列不夠長，片段化明顯，則可以嘗試增加 -D 和 -N, 雖然會增加運行時間，但是會提高重復(fù)區(qū)域的分辨率。如果后續(xù)的Hi-C，或者BioNano發(fā)現(xiàn)hifiasm組裝結(jié)果有比較多錯誤組裝，則可以適當降低 --purge-max, -s和 -O。或者設(shè)置 -u 關(guān)閉post-join 步驟，hifiasm通過該步驟提高組裝的連續(xù)性。
五．參考：
Ref1:Haplotype-resolved de novo assembly using phased assembly graphs with hifiasm
Ref2: https://zhuanlan.zhihu.com/p/283131167
Ref3：http://www.lxweimin.com/p/6d79690dce5d?ivk_sa=1025883j
Ref4: https://hifiasm.readthedocs.io/en/latest/trio-assembly.html
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