前言
植物基因組大小跨越幾個數(shù)量級，倍性和雜合性變化，以及新舊基因組轉(zhuǎn)座子變化等帶來組裝挑戰(zhàn)。三代和物理圖譜提供了新機會，單倍型定相、結(jié)構(gòu)變異分析、從頭泛基因組研究成為新興組裝熱點。
植物基因組發(fā)展：
- 擬南芥：sanger BAC-by-BAC。
- shotgun OLC （CELERA assembler）：木瓜、大豆、楊樹等早期測序植物。
- 454/Illumina DBG 短序列高深度帶來植物基因組組裝大爆發(fā)，但質(zhì)量較低。
- 單分子PacBio長度長帶來接近完整染色體組裝。
- 輔助技術(shù)發(fā)展：Hi-C/BioNano（無需昂貴的BAC物理圖譜）
- ONT納米孔能達(dá)上Mb，組裝擬南芥、番茄、高粱、香蕉、甘藍(lán)等更連續(xù)和完整的版本。
在過去20年種，有400多個植物基因組已發(fā)表，包括333個被子植物，15個非被子植物、2個輪藻和44個綠藻。
可查閱：
https://www.plabipd.de/portal/web/guest/sequenced-plant-genomes
1. 單分子長度長測序
PacBio通過CCS產(chǎn)生HiFi 15 kb reads的方法準(zhǔn)確率高達(dá)99.8％，解決了錯誤率問題，但每條read成本高了近5倍。
基因組測序的發(fā)展，在基因組完整度上已經(jīng)有了很大提升。
2. 長度長基因組組裝的錯誤傾向
新算法的設(shè)計目的：correct, overlap, and polish long reads with high error-rates。
算法隨計算設(shè)計、速度、內(nèi)存使用、復(fù)雜基因組利用而變化。
- 自糾方法self-correction：CANU、Falcon（phase/unzip）、MARVEL、MECAT。利用reads相互比對，需要較高覆蓋度。
- correction-free：基于OLC的minimap2/miniasm、基于DBG的wtdbg2和Flye。要求更高復(fù)雜度的基因組。
組裝的草圖有誤差，必須用高覆蓋度的長讀長或短讀長polish，一般大于三次可達(dá)到>99.6%的準(zhǔn)確性。
- long reads：Quiver/Arrow (PacBio)、Medaka (ONT)、Nanopolish、Racon。
- short reads：Pilon
PacBio CCS HiFi軟件：Peregrine
3. 物理圖譜技術(shù)
- a.Hi-C
-
b.Optical maps
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4. 解決復(fù)雜植物基因組
如下圖，兩條染色體組裝時定相，雜合基因組phasing有如下方法：
- 右上：嵌合假分子，簡化下游分析。
- 右中：原始reads比對到contigs，解決缺失的單倍型區(qū)域，建立一個定相的二倍體組裝。
-
右下：保留部分單倍型，并在基于圖的組裝中加以標(biāo)記。
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5. 利用組裝圖
組裝經(jīng)典指標(biāo)是N50，或者最短序列長度大于組裝的50%，方法過于簡單。
利用組裝圖可以可視化復(fù)雜度和鄰接contig的overlap。
- 純合簡單基因組（左上圖）：理想的graph對于每個contig（節(jié)點）只有一條邊和鄰接序列相連。
- 氣泡圖（左下圖）：高雜合性，節(jié)點（單倍型）被多條邊連接。
- 復(fù)雜重復(fù)（右上圖）：在圖結(jié)構(gòu)中較模糊，如rRNA,centromeric satellite DNA。
-
毛團(tuán)（hairballs，右下圖）：多拷貝重復(fù)，無清晰路徑，節(jié)點互交。
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當(dāng)參考基因組被泛基因組取代時，基因組圖論將是代表復(fù)雜基因組更好的方法。
挑戰(zhàn)和展望
挑戰(zhàn)：
- 多倍體和雜合度
展望：
- 基因組完整、少gap、定相。
- denovo替代重測序，挖掘更多多樣性，用于群體遺傳和泛基因組分析。
- 基因組注釋將落后于組裝，提高注釋質(zhì)量需要新技術(shù)（如全長cDNA，PacBio Iso-seq等）以及新算法。
參考文獻(xiàn)：Todd PMichael. Building near-complete plant genomes. Curr Opin Plant Biol. 2020 Apr;54:26-33.
