醫(yī)學(xué)科研實驗基礎(chǔ)知識筆記（四）：細胞自噬研究策略
細胞自噬是指細胞在外界環(huán)境因素的影響下， 細胞利用溶酶體降解自身受損、 變性或衰老的大分子物質(zhì)以及細胞器的自我消化過程。自噬是細胞的一種自我保護機制， 廣泛存在于真核細胞內(nèi)， 在調(diào)節(jié)細胞生存和死亡的過程中， 起著重要的作用。
當(dāng)細胞發(fā)生自噬后， 在自噬相關(guān)基因的調(diào)節(jié)下， 細胞通過單層或雙層膜， 包裹待降解的細胞質(zhì)或細胞器， 形成囊泡狀的自噬體（autophagosome） 。然后自噬體再和溶酶體（lysosome）
發(fā)生融合形成自噬溶酶體（autolysosome） ， 由溶酶體內(nèi)的一系列水解酶， 降解自噬溶酶體內(nèi)所包裹的內(nèi)容物， 以實現(xiàn)細胞對自身代謝和能量的更新。
1.自噬的細胞學(xué)分類及過程
根據(jù)細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)饺苊阁w的方式以及生理功能的差異， 哺乳動物的細胞自噬可以分為三種類型：大自噬/宏自噬（macroautophagy） ， 小自噬/微自噬（microautophagy） 和分子伴侶介導(dǎo)的自噬（chaperone-mediated autophagy， CMA） 。
1） 大自噬/宏自噬：我們通常所說的自噬指的就是大自噬/宏自噬。在大自噬的過程中， 細胞質(zhì)中可溶性的大分子物質(zhì)以及變性的細胞器， 被內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、 線粒體來源的單層或雙層膜包裹形成自噬體。接著自噬體的外膜與溶酶體膜融合， 進一步形成自噬溶酶體， 自噬體內(nèi)的待降解物被一系列的水解酶降解， 最終完成整個的自噬過程。
2） 小自噬/微自噬：與大自噬過程不同， 是溶酶體膜自身發(fā)生內(nèi)陷， 包裹和吞噬細胞內(nèi)待降解的底物， 并在溶酶體內(nèi)發(fā)生降解。小自噬與大自噬的區(qū)別就在于， 在小自噬過程中胞質(zhì)成份是直接被溶酶體包裹， 沒有形成自噬體的過程。
3） 分子伴侶介導(dǎo)的自噬：在分子伴侶介導(dǎo)發(fā)生的自噬過程中， 其待降解的底物都是可溶性的蛋白質(zhì)分子。分子伴侶蛋白識別帶有特定氨基酸序列的底物蛋白質(zhì)分子， 并與之結(jié)合， 然后再經(jīng)溶酶體膜上的受體 Lamp2a（lysosome-associated membrane protein 2， Lamp2） 轉(zhuǎn)運到溶酶體；底物蛋白分子再在溶酶體內(nèi)， 被水解酶降解。因此， 分子伴侶介導(dǎo)的自噬與前兩者不同， 在降解蛋白時具有選擇性。而大自噬和小自噬現(xiàn)象中， 一般而言， 在降解蛋白時沒有明顯的選擇性。
2.自噬信號通路
3.自噬與凋亡的關(guān)系
細胞凋亡也被稱為 I 型程序性細胞死亡；自噬則被稱為 II 型程序性細胞死亡。凋亡和自噬是兩種顯著不同的細胞死亡形式， 兩者在形態(tài)、 生化指標(biāo)以及調(diào)控細胞死亡的過程上都存在著較大的差異， 但兩者又不是兩個完全獨立的過程。許多研究表明， 凋亡和自噬的作用以及功能在某些情況下也是相互影響和制約的。自噬和凋亡之間存在著三種不同類型的相互作用，而且每種類型都對應(yīng)著相應(yīng)的特定的細胞類型、 刺激和環(huán)境。
1） 自噬和凋亡互相協(xié)同， 共同促進細胞死亡。兩種效應(yīng)之間， 可以其中一種效應(yīng)影響另一種效應(yīng)；自噬也可以作為凋亡的上游調(diào)節(jié)因子， 直接調(diào)控細胞凋亡， 從而影響細胞的死亡；
2） 自噬可以通過促進細胞存活而拮抗細胞的凋亡效應(yīng)。比如， 可以通過去除因氧化應(yīng)激受損的細胞器， 或降解變性的大分子物質(zhì)， 為饑餓的細胞提供生存所需要的營養(yǎng)和能量；或者通過降解未折疊的蛋白來抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激。自噬的這些功能將會抑制促凋亡信號的產(chǎn)生， 從而起到拮抗細胞凋亡的作用。
3） 自噬有時雖然自身并沒有導(dǎo)致細胞死亡， 但卻參與了細胞凋亡的過程。比如自噬參與了一些 ATP 依賴的凋亡過程。
4.自噬的分子機制和特征
1） 自噬誘導(dǎo)階段（induction） ：正常生理狀態(tài)下， 細胞保持很低的基礎(chǔ)自噬水平。這時細胞內(nèi)能量充足，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物 1(也就是 mTOR 復(fù)合物 1，也叫做 mTORC1)處于活化的狀態(tài)。活化的 mTORC1 通過磷酸化的方式使得 ATG13 發(fā)生磷酸化反應(yīng)， 從而抑制細胞的自噬。
2） 成核過程（vesicle nucleation） ：成核過程和 Vps34-ATG6 復(fù)合物密切相關(guān)。這個復(fù)合物還包含有調(diào)節(jié)性蛋白激酶 Vps15， 共同作用于膜泡的成核， 介導(dǎo) PAS(也就是前自噬體結(jié)構(gòu)pre-autophagosomal structure)的形成。
Vps34-ATG6 復(fù)合體還可以召集 ATG12-ATG5 和 ATG16 多聚體以及 LC3， 并通過后兩者促進吞噬泡的伸展擴張。請大家注意， Vps34 在哺乳動物中的同源蛋白是 class III PI3K；ATG6在哺乳動物中的同源蛋白是 Beclin-1， 所以 Vps34-ATG6 復(fù)合體， 也被稱為 PI3K-Beclin-1復(fù)合物。
3） 自噬體的延伸階段：這個過程的分子機制是最為復(fù)雜的。哺乳動物自噬體的延伸主要依賴于兩個類泛素化的系統(tǒng)：a） ATG12 的結(jié)合過程；b） LC3 的修飾過程。
ATG12 的結(jié)合過程是類似泛素化的過程， 需泛素活化酶 E1 和 E2 的參與。ATG12 首先由 E1樣酶 ATG7 活化， 再通過 E2 樣酶 ATG10 轉(zhuǎn)運并結(jié)合 ATG5， 然后和 ATG16 結(jié)合， 生成ATG12-ATG5-ATG16 的多體復(fù)合物。這個復(fù)合物定位于前自噬體結(jié)構(gòu)的外膜表面， 并參與前自噬體外膜的擴張。
LC3 在酵母中的同源基因是 ATG8。LC3 的修飾過程同樣需要類似泛素活化酶 E1 和 E2 的參與。LC3 前體形成后被 ATG4 加工成胞漿可溶性的 LC3-Ⅰ， 然后在 E1 樣酶 ATG7 和 E2樣酶 ATG3 的作用下， 和磷脂酰乙醇胺(PE)共價連接成為脂溶性的 LC3-PE（也就是 LC3-II），并參與膜的延伸。LC3-Ⅱ能夠與新形成的膜結(jié)合， 直到自噬溶酶體(Autolysosome)的形成。因此， LC3-Ⅱ常用作自噬形成的標(biāo)識物， 也是一種重要的定位于自噬泡膜上的多信號傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白。
哺乳動物的 ATG12-ATG5 類泛素化過程和 LC3 類泛素化過程并不是獨立運行的， 它們之間可以相互作用、 相互調(diào)節(jié)。
4） 自噬體的成熟階段：自噬體的成熟主要是指自噬體通過微管骨架在轉(zhuǎn)運必須內(nèi)吞體分類復(fù)合物(ESCRT)和單體 GTP 酶(Rab S)作用下， 與溶酶體融合形成自噬溶酶體的過程。參與成熟階段的溶酶體相關(guān)蛋白還包括：LAMP1、 LAMP2、 UVRAG(紫外線抵抗相關(guān)腫瘤抑制基因)。
5） 自噬體的裂解階段：是指自噬溶酶體膜的裂解及內(nèi)容物在溶酶體水解酶的作用下降解的過程。降解過程中產(chǎn)生的氨基酸及部分蛋白可以為細胞提供營養(yǎng)、 能量或循環(huán)利用。
5.自噬誘導(dǎo)劑
a) Bredeldin A / Thapsigargin / Tunicamycin ：模擬內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激
b) Carbamazepine/ L-690，330/ Lithium Chloride（氯化鋰）：IMPase 抑制劑（即Inositol monophosphatase，肌醇單磷酸酶）
c) Earle's平衡鹽溶液：制造饑餓
d) N-Acetyl-D-sphingosine（C2-ceramide）：Class I PI3K Pathway抑制劑
e) Rapamycin：mTOR抑制劑
f) Xestospongin B/C：IP3R阻滯劑
6.自噬抑制劑
a) 3-Methyladenine（3-MA）：（Class III PI3K） hVps34 抑制劑
b) Bafilomycin A1：質(zhì)子泵抑制劑
c) Hydroxychloroquine（羥氯喹）
除了選用上述工具藥外，一般還需結(jié)合遺傳學(xué)技術(shù)對自噬相關(guān)基因進行干預(yù)：包括反義RNA干擾技術(shù)（Knockdown）、突變株篩選、外源基因?qū)氲取?/p>
7.自噬的檢測手段
自噬的評估通常采用多個自噬階段的標(biāo)志物，因為自噬小體數(shù)量的增加可能是自噬上調(diào)也可能是自噬最后階段降解被抑制所致，所以設(shè)置合適的對照很有必要。
（1）透射電鏡，電鏡觀察自噬體和溶酶體的超微結(jié)構(gòu)；
（2）WB檢測標(biāo)志物L(fēng)C3/Atg8和p62/SQSTM1；生化檢測自噬體膜標(biāo)志蛋白， 特別是ATG12、 ATG5 和 LC3；熒光顯微鏡檢測 LC3 或GFP-LC3 斑點的形成；生化檢測自噬底物 p62。
（3）WB檢測Lamps、Atg5、Atg14和Beclin-1。
（4）組織蛋白酶Cathepsin活力檢測。
（5）IF檢測自噬潮autophagic flux
自噬過程進行觀察和檢測 細胞經(jīng)誘導(dǎo)或抑制后，需對自噬過程進行觀察和檢測，常用的策略和技術(shù)有：
（1）觀察自噬體的形成
由于自噬體屬于亞細胞結(jié)構(gòu)，普通光鏡下看不到，因此，直接觀察自噬體需在透射電鏡下。Phagophore的特征為：新月狀或杯狀，雙層或多層膜，有包繞胞漿成分的趨勢。自噬體（AV1）的特征為：雙層或多層膜的液泡狀結(jié)構(gòu)，內(nèi)含胞漿成分，如線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、核糖體等。自噬溶酶體（AV2）的特征為：單層膜，胞漿成分已降解。（autophagic vacuole，AV）
（2）在熒光顯微鏡下采用GFP-LC3融合蛋白來示蹤自噬形成
由于電鏡耗時長，不利于監(jiān)測（Monitoring）自噬形成，人們利用LC3在自噬形成過程中發(fā)生聚集的現(xiàn)象開發(fā)出了此技術(shù)。無自噬時，GFP-LC3融合蛋白彌散在胞漿中；自噬形成時，GFP-LC3融合蛋白轉(zhuǎn)位至自噬體膜，在熒光顯微鏡下形成多個明亮的綠色熒光斑點，一個斑點相當(dāng)于一個自噬體，可以通過計數(shù)來評價自噬活性的高低。
（3）利用Western Blot檢測LC3-II/I比值的變化以評價自噬形成自噬形成時，胞漿型LC3（即LC3-I）會酶解掉一小段多肽，轉(zhuǎn)變?yōu)椋ㄗ允审w）膜型（即LC3-II），因此，LC3-II/I比值的大小可估計自噬水平的高低。
（注意：LC3抗體對LC3-II有更高的親和力，會造成假陽性。需要多種檢測方法結(jié)合使用，同時需考慮溶酶體活性的影響。）
（4）檢測長壽蛋白的批量降解：非特異
（5）MDC（Monodansylcadaverine，單丹磺酰尸胺）染色：包括自噬體，所有酸性液泡都被染色，故屬于非特異性的。
（6）CellTrackerTM Green染色：主要用于雙染色，但其能染所有的液泡，故也屬于非特異性的。
自噬相關(guān)蛋白的定位 在研究自噬相關(guān)蛋白時，需對其進行定位。
由于自噬體與溶酶體、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體關(guān)系密切，為了區(qū)別，常用到一些示蹤蛋白在熒光顯微鏡下來共定位：
Lamp-2：溶酶體膜蛋白，可用于監(jiān)測自噬體與溶酶體融合。
LysoTrackerTM 探針：有紅或藍色可選，顯示所有酸性液泡。
pDsRed2-mito：載體，轉(zhuǎn)染后表達一個融合蛋白（紅色熒光蛋白+線粒體基質(zhì)定位信號），可用來檢測線粒體被自噬掉的程度（Mitophagy）。
MitoTraker探針：特異性顯示活的線粒體，熒光在經(jīng)過固定后還能保留。
Hsp60：定位與線粒體基質(zhì)，細胞死亡時不會被釋放。
Calreticulin（鈣網(wǎng)織蛋白）：內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔
（注意：這些蛋白均為胞漿蛋白，爬片或胰酶消化的細胞在做免疫熒光前需先透膜（permeablize），可采用0.1%SDS處理。）
8.自噬研究常規(guī)思路
通常情況下，除了研究自噬現(xiàn)象本身，大家更多的是將自噬與各種生命活動或者疾病結(jié)合起來，把自噬作為這些方向的一個機制來研究。比如研究自噬如何參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、如何參與腫瘤的耐藥性與復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移、如何參與腫瘤免疫治療的效果、如何參與炎癥反應(yīng)、如何參與氧化應(yīng)激，如何參與自閉癥、阿爾茲海默癥的發(fā)生與治療等，通常的研究模式：
（1）證明自噬參與了相關(guān)研究表型（電鏡、LC3II/I-WB、LC3亞細胞定位、LC3熒光示蹤監(jiān)測自噬流等）
（2）證明自噬在表型中起到關(guān)鍵作用（通過自噬抑制劑、激動劑進行關(guān)聯(lián)研究）找到表型與自噬橋梁分子（檢測pI3K通路、Beclin-1、ATG家族各成員）
（3）在基因?qū)用嫱ㄟ^gain of/lost of function研究橋梁分子在自噬中的作用。
9.研究自噬的文獻參考
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