基礎知識-研究方法-案例
1.基礎知識：
? ? 分類：非選擇性自噬-大自噬、小自噬、分子伴侶介導的自噬；
? ? ? ? ? ? ? ? 選擇性自噬-線粒體自噬 (mitophagy)、聚集體自噬 (aggrephagy) 等選擇性自噬；
? ?一、大自噬形成過程：3步：內質網和高爾基體等形成環狀結構，包裹胞內結構形成雙層膜囊泡結構，即自噬體；然后自噬體與溶酶體融合；自噬體內蛋白或者細胞器在溶酶體內被溶酶體酶講解。（三類標志物：囊泡形成過程的標志物、溶酶體標志物、自噬底物標志物）
? ? ? ? ? ? ?囊泡形成過程的標志物:?（1） Atg12-Atg5復合物---WB檢測：Atg12--15 kDa；Atg5--32 kD；復合體--55 kDa；（2）Atg16L1--Atg12-Atg5- Atg16L1復合物，不過自噬體形成后就離開了；檢測早期自噬體的形成-方法：進行免疫透射電鏡和免疫染色的檢測；（3）LC3參與了自噬體膜的形成，包括相互轉化的形式即LC3-I和LC3-II（細胞內新合成的LC3經過加工, 成為胞漿可溶形式的LC3-I, 后者經泛素化加工修飾, 與自噬體膜表面的PE結合, 成為膜結合形式的LC3-II。LC3-II定位于前自噬體和自噬體, 是自噬體的標志分子, 隨自噬體膜的增多而增加）；檢測方法--WB ：?LC3-I 18 kDa, LC3-II 16 kDa；（盡管PE偶聯形式的LC3-II的分子質量較LC3-I大, 但是其具有強疏水性, 因此在SDS-PAGE中電泳遷移率反而比LC3-I (非PE偶聯的LC3) 快，可以通過Western blot比較組間LC3-II水平, 也可通過計算LC3-II/LC3-I的比值來評價LC3-II水平, 并推測自噬囊泡數量的多少。）注意：LC3在含SDS的樣品裂解液中易降解, 因此樣品經煮沸裂解后應當盡快進行Western blot實驗,并避免反復凍融。?（4）Atg9/mAtg9 --Atg蛋白中唯一的跨膜蛋白；哺乳動物細胞的為mAtg9，在形成成熟自噬體后, mAtg9并未整合進自噬體囊泡上, 而是又游離進入胞漿；用來檢測為自噬的發生；（5）Atg6/Beclin1：用熒光顯微鏡或透射電鏡可檢測Beclin1-GFP的點狀聚集或斑塊作為自噬標志物 ? ? ? ? ? ?溶酶體標志物：一般為溶酶體膜蛋白：溶酶體相關膜蛋白1 (lysosome-associated membrane protein type 1, LAMP- 1)、LAMP-2和溶酶體整合膜蛋白 (lysosomal integral membrane protein, LIMP-2)--檢測方法：可用免疫組化或Western blot的方法檢測溶酶體重要膜蛋白的水平, 并與其他自噬相關蛋白結合使用。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?自噬底物標志物：p62也被稱為SQSTM1, 在多種細胞和組織中 都有表達, 可作為一個貨車蛋白參與多種信號轉導過程。p62可連接LC3和泛素化的底物, 隨后被整合到自噬體中, 并在自噬溶酶體中被降解；當自噬被激活時自噬體與溶酶體融合, 自噬囊泡中p62等蛋 白或細胞器被溶酶體酶降解, p62水平降低; 當自噬被抑制時自噬體積累, p62水平升高。因此, 可以用Western blot方法檢測p62的水平, 作為自噬能力變化的指征。
二、CMA的標志物：CMA是胞漿內某些蛋白質被分子伴侶如熱休克蛋白質70 (heat shock cognate protein of 70 kDa, HSC70) 識別, 并將其運送到溶酶體膜上, 再經溶酶體膜蛋白LAMP-2a結合后被轉運到溶酶體腔中被溶酶體酶消化的過程，與大自噬和小自噬相比, CMA的主要特點是細胞質內的蛋白質直接經溶酶體膜蛋白轉運入溶酶體腔, 不需形成自噬囊泡。（1）HSC70 ?70 kDa的熱休克同源蛋白, 它是分子伴侶, 在胞漿識別帶有KFERQ樣序列的CMA底物；（2）?LAMP-2a ?CMA的速率直接依賴于溶酶體膜上LAMP-2a的含量，LAMP-2a在胞內的水平可由于轉錄水平改變或降解速率改變而發生變化。抑制LAMP-2a將引起CMA底物GAPDH的聚集; 過表達LAMP-2a, 則引起GAPDH水平下降。
三、線粒體自噬標志物
? ? ? ? ?線粒體自噬指在ROS、營養缺乏和細胞衰老等內外環境的刺激下, 細胞內的線粒體發生去極化, 而這些被損傷的線粒體將被特異性地包裹進自噬體中并與溶酶體融合, 從而完成損傷線粒體的降解, 維持細胞內環境穩定的過程。
? ? ? ? ?流程：損傷的線粒體在發生線粒體自噬之前先發生動力相關蛋白1 (dynamin-related protein 1, DRP1) 介導的 線粒體分裂。線粒體膜電位的下降引起PTEN誘導假定激酶 (phosphatase and tensin homolog-induced putative kinase 1, PINK1) 的聚集, 接著招募E3泛素連接酶Parkin到線粒體。Parkin促進線粒體膜上蛋白質泛素化, p62蛋白與線粒體上泛素化蛋白相互作用, 借助p62與LC3的互作引導線粒體被自噬體包裹[24]。同時, 線粒體上存在自噬受體如BNIP3 (Bcl-2 and adenovirus E1B 19-kD interacting protein 3) 和NIX/ BNIP3L (BNIP3-like) 也可以與LC3互作使得受損線粒體通過自噬方式被去除。 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?通常用線粒體標志物和自噬標志物LC3共定位來顯示線粒體自噬。此外, 還有幾個線粒體自噬受體也可以考慮用作線粒體自噬的標志。
? ? ? ? ?（1）Atg32是一個分子質量約59 kDa的跨膜蛋白, 定位在線粒體外膜上；
? ? ? ? （2）BNIP3和NIX ?BNIP3和NIX序列上有56% 的同源度, 且都有BH3結構域, 并與Bcl-2作用。
? ??分子標記：如下圖 ? （ATG5，LC3）
? ? ? ??LC3：?Atg8/微管相關蛋白1輕鏈3 (microtubule- associated protein1 light chain 3, LC3)
reference：http://html.rhhz.net/YXXB/html/20160106.htm?
2.研究方法：一般都是WB
3.研究案例：
本文就從最近師兄推給我的一篇文章，一起學習一下吧。
總結一下：本文思路蠻清晰的簡單的，動物與細胞表型；通路的探討；直接作用的證明。其中，直接作用的證明用了模擬方式，沒有通過實驗。
這樣就會想到：驗證直接相互作用的方法：蛋白之間-蛋白DNA之間-蛋白RNA之間 相互作用，不管是酵母雙雜交、CO-IP、pulldown、ChIP
