SQSTM1/p62 知多少？
原創 瞿飛；經作者同意轉自 Autophagy
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導語： Sequestosome-1（ 是一種重要的選擇性自噬接頭蛋白，其含有泛素相關結構域、Kelch樣環氧氯丙烷相關蛋白的作用區、微管相關蛋白1A/1B輕鏈3作用域、腫瘤壞死因子受體相關因子6、Phox和Bem1p結構域和ZZ 型鋅指區6個功能區域。SQSTM1/p62在清除泛素化蛋白中起著重要作用，它同時調節核轉錄相關因子2-抗氧化反應元件、NF-κB 和胱天蛋白酶8 介導的凋亡等信號通路；SQSTM1/p62的異常表達與神經退行性病變（如亨廷頓病、阿爾茨海默病、帕金森病）、腫瘤、感染性疾病、遺傳性疾病以及慢性疾病的發生發展過程密切相關。
自噬是真核細胞內高度保守的溶酶體介導的降解機制，主要負責清除錯誤折疊的蛋白質、受損的細胞器等，對于維持細胞穩態起著重要作用。根據底物靶向運輸至溶酶體方式的不同，自噬可分為大自噬、小自噬和分子伴侶介導自噬。通常所說的自噬主要指大自噬，其基本過程包括自噬啟動、前自噬泡膜延長、自噬泡膜閉合形成直徑約為1 μm的自噬體、自噬體與溶酶體融合、以及自噬溶酶體內底物的降解。最初普遍認為自噬是非選擇性的，如營養缺乏能誘導細胞產生非選擇性自噬，細胞通過吞噬降解一些非必需細胞成分包括蛋白質和細胞器，以提供能量和關鍵的代謝物質如氨基酸，維持細胞的基礎代謝和存活。然而，近年研究發現自噬可通過受體蛋白選擇性地清除細胞內的蛋白質聚合物、受損的細胞器（如線粒體和過氧化物酶體）。 SQSTM1/p6是第一個被發現的具有這種功能的受體，越來越多的證據支持p62與神經退行性疾病、免疫性疾病和人類腫瘤等多種疾病發生有關。
1、SQSTM1/p62蛋白
SQSTM1/p62 是一種多功能的蛋白，在大鼠、小鼠、人類和果蠅中分別稱為ZIP，A170，SQSTM1和 Ref2cp。SQSTM1/p62 分子質量是 62 ku，在胞漿中以散在點狀或者聚集形式存在，可在胞質和細胞核間轉運，最初是作為非典型蛋白激酶 C（atypical protein kinase C，aPKC）的配體被發現的。p62蛋白含440個氨基酸，主要包括6個功能區：①位于C端的能連接泛素化底物的泛素結合結構域；②同泛素接頭蛋白 Kelch 樣環氧氯丙烷相關蛋白1相互作用的Keap1作用區；③同自噬體膜上的受體蛋白微管相關蛋白 1A/1B輕鏈3，LC3相互作用的結構域；④同E3泛素連接酶腫瘤壞死因子受體相關因子6，TRAF6結合的TRAF6 結構域；⑤同受體作用蛋白1蛋白激酶結合的 ZZ 型鋅指結構域；⑥處于 N 端的A、B 類型 Phox 和 Bem1p（PB1）結構域，其可以通過自身聚合或與 PKC、細胞外信號調節激酶 5的激酶、BRCA1 基因1鄰位蛋白和p62等作用形成同二聚體或異二聚體。p62的多功能結構使之成為多個信號通路中心，參與細胞基本功能的維持與調控。因此，p62/SQSTM 1功能異常能導致多種信號通路的受阻、蛋白異常聚集從而誘導各種疾病的發生。
2、SQSTM1/p62在細胞內蛋白質代謝中的作用
細胞在生長代謝和應激過程中會不斷產生一些錯誤折疊的蛋白和受損的細胞器等，及時清除這些底物是細胞維持自身穩態和正常生理活動的關鍵。真核細胞主要依靠自噬-溶酶體和泛素-蛋白酶體系（ubiquitin-proteasomesystem，UPS）兩種蛋白降解機制來完成細胞內蛋白質的新陳代謝。其中，UPS主要清除一些可溶性小分子蛋白，而自噬-溶酶體則負責清除蛋白聚合物和受損的細胞器。
根據靶蛋白的屬性，自噬可分為非選擇性自噬和選擇性自噬。盡管兩者有許多共同的機制，但在調控機制上還是有許多不同之處。例如，在哺乳動物細胞中，被選擇性自噬降解的蛋白通常都是特定化學修飾的蛋白，如泛素化蛋白。同時，選擇性自噬通常需要一些接頭蛋白如p62和NBR1的存在，這些蛋白具有泛素結合結構域和LC3相互作用的模序，因此能結合泛素化修飾的蛋白，并運輸到自噬體。
作為重要的選擇性自噬接頭蛋白p62在清除泛素化蛋白過程中作為受體參與其中。研究發現，p62主要通過其UBA（Ser403位點）結構域、LIR（Ser351位點）結構域的磷酸化，分別與泛素化蛋白和 LC3/Atg8 連接，同時通過 PB1 發生自身寡聚化，最終進入自噬溶酶體完成泛素化底物降解。此外，p62也可將泛素化蛋白運送到蛋白酶體降解。正是依賴p62的樞紐作用，細胞內的兩個主要蛋白降解機制建立起了內在的聯系，二者相互依賴，相互補充。由于UPS主要清除一些可溶性小分子蛋白，因此，當蛋白酶體功能出現故障以及大量聚集性蛋白出現時，自噬就成為唯一的清除途徑。同時，細胞內受損的或衰老的細胞器也可通過自噬途徑降解。例如，p62能通過Pink1-Parkin介導泛素的線粒體的清除，有研究報道，Pink1是一種重要的線粒體激酶，在Parkin 蛋白上游發揮作用當使用解偶聯劑、羰基氰化間氯苯腙處理之后，Pink1 發生積累，進而招募到受損線粒體上。與此同時，p62 通過電壓依賴性陰離子通道蛋白1（volt?age-dependent anion channel 1 protein，VDAC1）在線粒體膜上聚集，最后經p62-LC3進入自噬-溶酶體系統降解。
由于在溶酶體降解過程中，與底物結合的p62被蛋白水解酶降解。因此，p62水平升高通常被認為是自噬活性受到抑制的標志。在實際檢測過程中，p62水平升高與自噬激活相伴隨的現象并不少見，特別是在毒物刺激和氧化應激情況下更為常見。其原因可能是p62作為一種應激蛋白，在應激條件下其表達水平會大幅度上調，這一過程主要受轉錄因子 EB（transcription factor EB，TFEB）調控。正是鑒于 p62 與自噬之間的復雜關系，同時由于細胞自噬本身是一個高度動態的、多階段的過程。因此，在判定細胞自噬活性變化時，需要評價自噬流的變化，即自噬體形成、自噬體與溶酶體融合、底物降解等的動態變化。
p62與自噬的關系具有雙向性。一方面細胞內p62水平嚴格受自噬活性的調控，另一方面p62也能通過激活哺乳類動物西羅莫司（雷帕霉素）靶蛋白復合物1〔mammalian target of sirolimus（rapamycin）complex 1，mTORC1〕信號通路負性調節細胞的自噬活性。mTOR是一種非典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，能形成兩種復合物，一種與 mTOR調節相關蛋白（regulatory- associated protein of mTOR，raptor）結合形成mTORC1，一種是與西羅莫司不敏感的mTOR伴侶（Rapamycin insensitive companion of mTOR，rictor）形成mTORC2。其中，p62可通過直接作用raptor蛋白，激活 mTORC1復合物抑制細胞自噬活性。p62的缺失會降低mTORC1的活性，相反過度表達p62 會提高活性。自噬抑制會導致p62的聚集，然后會提高mTORC1的水平，繼而進一步抑制自噬，促使p62聚集。
3、與p62功能相關的信號調控通路
近年研究發現，p62不僅在細胞蛋白質量控制中起關鍵作用，更為重要的是它還能通過自身的寡聚化，參與細胞內多條重要信號通路的調控。
3.1、p62與核因子E2相關因子2-抗氧化反應元件信號通路
氧化應激是指機體內氧化與抗氧化系統失衡所導致的一系列適應性反應。大量積累的活性氧和活性氮能引起細胞內蛋白質、脂類和DNA等重要生物大分子的損傷，因此，氧化應激被認為與神經退行性疾病、動脈粥樣硬化和腫瘤等多種人類疾病發生有關。核轉錄相關因子核因子E2相關因子2（nuclear factor erythroid 2 related factor 2，Nrf2）-抗氧化反應元件（antioxidant response element，ARE）信號通路是近年發現的機體抵抗內外環境氧化和化學等刺激的重要防御性轉導通路。
Nrf2 是屬于堿性亮氨酸拉鏈（bZIP 蛋白）家族的轉錄因子。生理條件下，Nrf2在細胞質中與滯蛋白（cullin）-3型泛素連接酶接頭蛋白Keap1結合處于非活性狀態，并由蛋白酶體降解。當細胞暴露于親電子物（electrophile）、活性氧和受化學物質刺激時，Keap1 的半胱氨酸殘基發生化學修飾，引起其構象改變，導致Nrf2與Keap1解離而活化。活化的Nrf2轉位進入細胞核，與ARE結合，啟動ARE下游的Ⅱ相解毒酶、抗氧化蛋白、蛋白酶體/分子伴侶等基因轉錄和表達以抵抗內外界的有害刺激。
最近研究證明，在自噬活性受到抑制引起胞內p62 大量聚集時，p62 能直接激活該信號通路。其作用機制是胞內大量聚集的p62在蛋白激酶作用下特定氨基酸位點發生磷酸化（主要磷酸化位點是Ser403 和 Ser351）。磷酸化的p62 通過 KIR 區域結合 Keap1，釋放 Nrf2，從而入核啟動下游基因表達（圖1）。尤其值得關注的是，p62與Nrf2二者之間存在一個正反饋的關系。即p62增加，能激活Nrf2 通路，促進下游基因的表達，其中包括 p62 基因，因而能進一步加劇p62的聚集。
負責 p62 磷酸化的蛋白激酶迄今尚未真正確認。有證據顯示，mTOR和蛋白激酶CK2的激活可能與 p62 過度磷酸化有關。最新的研究提示UNC51 樣激酶 1（UNC-51-like kinase-1，ULK1）與 p62 磷酸化有關。總之，至于是何種激酶直接負責p62的磷酸化仍待進一步研究證實。
Nrf2-ARE信號通路不僅在自噬缺陷的小鼠肝中被激活，且在多種細胞應激反應和抵御氧化損傷中起關鍵作用。近年研究證實，許多藥物和植物提取物，如非諾貝特（fenofibrate）和黃酮槲皮素（flavonoidquercetin）正是通過激活 Nrf2 信號通路而發揮作用的。此外研究還發現，生長調控因子sestrin也能通過p62依賴的自噬性Keap-1降解方式來激活Nrf2信號通路。
3. 2、p62與NF-κB信號通路
NF-κB是包含 5 個亞單位的轉錄因子蛋白家族，通常情況下，它與核因子抑制蛋白IκB（inhibitor of NF-κB，IκB）形成復合物以無活性的形式存在于胞漿中。在細胞受到外界刺激的條件下，IκB 激酶（IκB kinase，IKK）激酶活化引起 IκB 磷酸化，磷酸化的 IκB 經泛素化后被降解，從而釋放出 NF-κB。隨后NF-κB進入細胞核與靶序列結合，啟動下游相關基因的轉錄。NF-κB 通路對于細胞生存具有重大意義，參與免疫炎癥反應過程中諸多活性分子如腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor α，TNF-α），白細胞介素（interleukin，IL）-1β，IL-2，IL-6和IL-8等表達的調控，與炎性反應、腫瘤形成等多種病理生理過程有關。
目前研究證實多種腫瘤細胞存在自噬缺陷，同時伴有大量 p62 聚集，并且與 NF-κB 調控有關。p62調控NF-κB主要有兩種方式，其一是通過PB1結構域結合aPKC、ZZ結構域結合RIP，激活TNF-α信號介導的 NF-κB 通路；其二是通過 TB 結構域結合TRAF，形成p62-TRAF6-IKKβaPKC的信號復合物激活NFκB 通路。在此通路中，p62 與 MAPK 激酶激酶前端基本區域MEKK3結合作為活動中心募集 TRAF6 及其他聚合物。更重要的是，p62 與TRAF6 結合能促進其寡聚化，并增強TRAF6的泛素化，最終多聚泛素化的 TRAF6 能誘導NF-κB 的激活。信號接頭蛋白 p62 能被原癌基因 ras 所誘導。在人類腫瘤中p62 水平升高，這是 Ras 誘導細胞存活和惡性轉化所需。相反，p62（-/-）小鼠對Ras誘導的肺腺癌具有抵抗性。作用機制是 p62 誘導的 TRAF 多聚泛素化是 Ras 激發IKK所需，結果會造成p62缺陷細胞內活性氧水平升高，這可能與 p62 缺陷細胞死亡率增加和 ras基因致腫瘤性下降有關。
3.3、p62與胱天蛋白酶8介導的凋亡信號通路
凋亡是由基因控制的細胞程序性死亡過程，在維持機體發育和內環境的穩定方面起著重要的作用。細胞凋亡可通過內外源兩個途徑觸發，而胱天蛋白酶8主要與細胞外源性凋亡信號途徑有關。
在外源性凋亡過程中，凋亡配體TRAIL與細胞膜表面的死亡受體 4（death receptor 4，DR4）和DR5結合后募集Fas 相關死亡域蛋白，通過DD聚集作用，死亡反應區端進一步募集到胱天蛋白酶8前體，最后形成死亡誘導信號復合物（death-inducingsignaling complex，DISC）。胱天蛋白酶 8 作為DISC的組成部分，能被cullin3泛素連接酶泛素化，泛素化的胱天蛋白酶8能與p62作用。隨后，p62促進DISC復合物的聚集從而驅動細胞凋亡程序。細胞內 p62陽性聚集物可以作為一個決定細胞生存死亡的信號中樞：通過激活TRAF6-NF-κB 信號通路促進細胞存活；或通過促使胱天蛋白酶8和下游效應胱天蛋白酶8的活化，誘導細胞凋亡。
p62-核因子E2相關因子2（Nrf2）-抗氧化反應元件（ARE）信號通路. 細胞質中，一般Keap1-Nrf2通過Nrf2的泛素化被蛋白酶體降解；當細胞受親電體（electrophile）或活性氧（ROS）刺激時，Keap1-Nrf2復合物解離，Keap1結合P62通過自噬降解，Nrf2進入細胞核內作用于ARE進而激活抗氧化基因和自噬相關基因表達。mTOR1：哺乳類動物西羅莫司（雷帕霉素）靶蛋白復合物1；P：磷酸化；ub：泛素化；TBK1：TANK結合激酶；CK2：酪蛋白激酶2
4、p62在疾病發生中的作用
在自噬相關性疾病如神經退行性疾病、腫瘤和炎癥等都會出現各種相關調控蛋白和泛素蛋白的聚集物，而p62是這些聚集物的作用中心。
4.1、p62與神經退行性疾病
2002年，Ravikumar等最早提出神經退行性病變的發生與神經元自噬異常有關，短短十幾年時間自噬已成為神經科學領域的研究熱點。研究發現，阿爾茨海默病（Alzheimerdisease，AD）和帕金森病（Parkinsondisease，PD）等多種神經退行性疾病中都存在神經元自噬活性的改變。現有研究表明p62作為自噬接頭蛋白與上述神經退行性病變發生直接相關。
亨廷頓病（Huntingtondisease，HD）是由于基因編碼區CAG序列過度擴張，造成大量錯誤折疊蛋白（htt蛋白）聚集而引發的神經退行性疾病。已有研究發現，polyQ 蛋白的錯誤折疊導致神經元變性。Nagaoka等［11］研究早就提出p62可偶聯polyQ蛋白，形成泛素化蛋白聚集物。然而，p62的作用機制迄今仍然不是很清楚。在 HD 小鼠模型中發現，敲除p62將增加胞質中polyQ蛋白聚集。這些研究表明，變性的htt蛋白可能通過p62聚集作用進行選擇性自噬途徑清除。
AD 是一種典型的神經退行性疾病，其病因主要包括tau蛋白過度磷酸化學說和神經細胞凋亡學說等。早在2001年人們就發現了p62和泛素化蛋白在AD患者神經元和神經膠質細胞中大量聚集。大量文獻表明，AD與自噬性降解缺陷有關，p62通過UBA結構域連接多聚泛素化tau蛋白，引導其進入自噬體系統降解。然而p62和神經原纖維纏結、其他聚集物結合抑制了它降解泛素化 tau 蛋白能力，成為AD發病原因之一。越來越多的證據表明，線粒體功能障礙在AD發病機制中起著關鍵的作用。p62的PB1區域異常會阻礙損壞的線粒體清除。
PD是一種黑質多巴胺神經元進行性丟失的神經退行性疾病，突變的α-突觸核蛋白以及泛素蛋白陽性路易小體的異常聚集是主要的病理特征。許多體內體外研究結果發現p62存在于路易小體聚集物中，α-突觸核蛋白聚集物需要p62受體蛋白才能進入自噬-溶酶體清除。體外細胞實驗同樣表明，p62敲除導致錯誤折疊的α-突觸核蛋白聚集物降解效率極大的降低。
4.2、p62與腫瘤
細胞自噬與腫瘤發生之間的關系存在雙重性。一方面，在正常細胞和腫瘤細胞形成的早期階段，細胞自噬起抑制腫瘤發生的作用，尤其是在肝腫瘤中表現得特別明顯。如研究發現，atg5或atg7基因敲除小鼠會出現自發性肝腫瘤，而p62的堆積至少部分與腫瘤發生有關。因為當同時敲除p62時，atg7-/- 小鼠肝腫瘤體積明顯變小。
在人類和小鼠腫瘤組織中發現了p62大量聚集以及自噬相關基因beclin1的缺失。如人類中至少 60%的肺腺癌和 90%的肺鱗癌中出現 p62 水平的升高。所有這些結果均支持自噬缺陷導致的p62聚集在腫瘤形成中起重要作用。細胞內p62聚集提高了患腫瘤的可能性，這可能同它激活了兩個活性氧清除系統有關，分別是 Nrf2 和 NF-κB，最后使癌細胞存活下來。同時，p62積聚也使基因組不穩定從而促進腫瘤的發展。因此，通過激活自噬降低p62水平是一種有效的抗腫瘤策略，它既能阻斷NF-κB轉錄活性，同時又下調Nrf2水平減少腫瘤細胞抗藥性和提高腫瘤細胞死亡率。
然而一旦腫瘤形成后，自噬卻能促進腫瘤細胞的存活和增殖。這主要是由于腫瘤細胞代謝旺盛，嚴重依賴于自噬來提供能量和營養需求的原因。考慮到自噬在腫瘤進展中的作用，抑制自噬活性也被作為在腫瘤進展階段的一種腫瘤治療策略。同時，由于p62能激活胱天蛋白酶8凋亡途徑也可起到癌癥治療的作用。目前已觀察到 p62 缺陷細胞中NF-κB 信號通路活性下降導致活性氧清除減少，最終能引起細胞內活性氧水平的升高和更多細胞發生凋亡。這也許能解釋p62缺陷細胞腫瘤活性下降的現象。
4.3、p62與其他疾病
隨著細胞自噬機制研究的不斷深入，越來越多的研究支持 p62 參與了其他多種疾病如感染性疾病、遺傳性疾病以及慢性疾病的發生發展過程。
當細胞體內侵入細菌時將會通過異體自噬起到保護作用。沙門菌屬侵入細胞內，p62會在細菌周圍聚集，p62 的 UBA 結構域（Ser403 位點）通過TBK1 激酶磷酸化，可增強 p62 易位使微生物形成泛素陽性包涵體；隨后，p62的KIR結構域（Ser351位點）磷酸化，使Keap1進入泛素陽性包涵體，通過自噬途徑將菌清除。
佩吉特病是一種遺傳性疾病，主要特征是骨質破壞和重建過程交替發生，并伴有并發癥出現。目前研究發現，p62的缺失會制NF-κB受體活化因子配體誘導的 NF-κB（UBA 區域缺失或突變）信號通路，將會導致破骨細胞異常的佩吉特病。
肥胖伴隨著炎癥的產生，p62通常抑制肥胖和提高能量消耗。已有研究表明，p62 可與 ERK1 和蛋白激酶 Cz 作用調節代謝平衡。p62-ERK1 調節成熟性肥胖和2型糖尿病，而p62-蛋白激酶Cz調節肥胖誘導的炎癥和2型糖尿病。
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