一、 基本介紹
rMATS是一款對RNA-Seq數據進行差異可變剪切分析的軟件。其通過rMATS統計模型對不同樣本（有生物學重復的）進行可變剪切事件的表達定量，然后以likelihood-ratio test計算P value來表示兩組樣品在IncLevel（Inclusion Level）水平上的差異，并利用Benjamini Hochberg算法對p value進行校正得FDR值。（lncLevel是Exon Inclusion Isoform在總Isoform（Exon Inclusion Isoform + Exon Skipping Isoform）中所占比例。）
rMATS可識別的可變剪切事件有5種，分別是外顯子跳躍（skipped exon, SE），選擇性5’剪接位點（alternative 5' splice site, A5SS），選擇性3’剪接位點（alternative 3' splice site, A3SS），外顯子互斥（mutually exclusive exons, MXE）和 內含子保留（retained intron, RI）。
官方文檔：
https://github.com/Xinglab/rmats-turbo/blob/v4.1.2/README.md
二、 使用方法
(1) 輸入
rMATS支持兩種格式文件的輸入。
- 第一種是fastq格式，那么在安裝的時候還需要安裝STAR比對軟件以及提供比對的索引文件（STAR的索引文件異常的大），所以rMATS其實是建議使用第二種方式；
- 第二種是bam格式，rMATS支持其他比對軟件比對后的結果bam文件作為輸入，比如tophat/ hisat2等，這樣也能減少rMATS的運行時間。
(2) 方法
目前rMATS 4.1版不受限于單雙端測序，reads長度不一，是否存在生物學重復，是否有比較組，是否需要檢測新轉錄本，是否鏈特異性等條件，并且其可以進行分步，分機器計算，功能完善，主要可變剪切事件檢測完整的一款軟件。
$ conda create -n bioinf3
$ conda activate bioinf3 #python 3.9
$ conda install -c bioconda rmats=4.1.2
$ conda install -c bioconda rmats2sashimiplot
$ rmats.py –version
$ rmats2sashimiplot --help
構建索引：
$ for i in `ls ./04_bam/*.bam` ; do (samtools index $i -@ 4) ; done &
運行rmats.py：
$ rmats.py --b1 ./06_rmats/LF.txt --b2 ./06_rmats/CF.txt --gtf ./annotation/genome/Drosophila_melanogaster.BDGP6.32.105.gtf --od ./06_rmats/ -t paired --readLength 150 --cstat 0.0001 --nthread 4 --libType fr-firststrand --tmp ./06_rmats/tmp/ &
(3) 參數
--b1 b1.txt：輸入sample1的txt格式的文件，文件內以逗號分隔重復樣本的bam文件名（/path/to/1_1.bam,/path/to/1_2.bam）
--b2 b2.txt：輸入sample2的txt格式的文件，文件內以逗號分隔重復樣本的bam文件名（/path/to/2_1.bam,/path/to/2_2.bam）
-t {paired,single}：雙端測序則readType為paired，單端測序則為single
--readLength：測序reads的長度
--gtf gtfFile：需要輸入的gtf文件
--od outDir：所有輸出文件的路徑（文件夾）
--nthread：設置線程數
--cstat：The cutoff splicing difference. The cutoff used in the null hypothesis test for differential splicing. The default is 0.0001 for 0.01% difference. Valid: 0 ≤ cutoff < 1. Does not apply to the paired stats model. 代表的是兩個樣本中inclusion level的差值
--libType {fr-unstranded,fr-firststrand,fr-secondstrand}：Library type. Default is unstranded (fr-unstranded). Use fr-firststrand or fr-secondstrand for strand-specific data.
--bi STARIndexFolder：The folder name of the STAR binary indexes (i.e., the name of the folder that contains SA file). For example, use ~/STAR_index/hg19 for hg19. (Only if using fastq)
--paired-stats：使用配對統計模型
--variable-read-length：Allow reads with lengths that differ from –readLength to be processed. --readLength will still be used to determine IncFormLen and SkipFormLen
--tmp TMP：The directory for intermediate output such as ".rmats" files from the prep step
(4) 結果
- AS_Event.MATS.JC.txt 僅用跨剪接點的reads來計算剪接
- AS_Event.MATS.JCEC.txt 使用跨剪接點的reads和在條紋區域的reads來計算剪接
- fromGTF.AS_Event.txt 所有來源于GTF和RNA的可能的選擇性剪接(AS)事件
- JC.raw.input.AS_Event.txt 事件計數包括僅跨越由rMATS定義的剪接點的reads
- JCEC.raw.input.AS_Event.txt 事件計數包括跨越由rMATS定義的剪接點的reads和不跨越外顯子邊界的reads
其中JC和JCEC的區別在于前者考慮跨越剪切位點的reads，而后者不僅考慮前者的reads還考慮到只比對到第一張圖中條紋的區域（也就是說沒有跨越剪切位點的reads），但是我們一般使用JC的結果就夠了（如果只是單純的比較兩組樣品間可變剪切的差異的話）。
以SE.MATS.JC.txt為例：
1）ID
2）GeneID
3）geneSymbol
4）chr
5）strand
外顯子的位置信息：
6）exonStart_0base
7）exonEnd
8）upstreamES
9）upstreamEE
10）downstreamES
11）downstreamEE
12）ID
13-16列展示兩組樣品在inclusion junction counts（IJC）和skipping junction counts（SJC）的count數，重復樣本的結果以逗號分隔；列名分別為IJC_SAMPLE_1，SJC_SAMPLE_1，IJC_SAMPLE_2，SJC_SAMPLE_2。
下面幾列為：
17）lncFormLen：length of inclusion form, used for normalization（inclusion形式的有效長度）
18）SkipFormLen：length of skipping form, used for normalization（skipping形式的有效長度）
19）P-Value：Significance of splicing difference between two sample groups（兩組樣品選擇性剪接差異的顯著性）
20）FDR：False Discovery Rate calculated from p-value
21）lncLevel1：inclusion level for SAMPLE_1 replicates (comma separated) calculated from normalized counts（從歸一化計數計算的SAMPLE_1重復的inclusion水平，逗號分隔）
22）IncLevel2：inclusion level for SAMPLE_2 replicates (comma separated) calculated from normalized counts（從歸一化計數計算的SAMPLE_2重復的inclusion水平，逗號分隔）
23）IncLevelDifference：average(IncLevel1) - average(IncLevel2)（兩組樣本IncLevel均值的差異）
其中：
lncLevel = Exon Inclusion Isoform / (Exon Inclusion Isoform + Exon Skipping Isoform)
lncLevel = (IJC_SAMPLE / lncFormLen) / (SJC_SAMPLE / SkipFormLen)
effective length = segment length / read length + 1
在輸出的結果文件中還有一個summary文本文檔，在該文件中統計了上述各個文件中的可變剪接事件數，其中SignificantEventsJC默認為JC文件中滿足FDR值小于等于0.05的事件數。
(5) 可視化
rmats2sashimiplot是專門用來對rMATS分析結果做可視化的軟件。可以預先用samtools對bam文件建立索引，不然rmats2sashimiplot會先建索引，比較慢。rMATS的結果文件中，如SE.MATS.JC.txt中染色體都是默認加上chr的，而bam文件中的染色體根據基因組注釋文件來源不同不一定有chr，需要使兩者一致。
方法：
$ rmats2sashimiplot --b1 ./04_bam/LF1.bam,./04_bam/LF2.bam,./04_bam/LF3.bam --b2 ./04_bam/CF1.bam,./04_bam/CF2.bam,./04_bam/CF3.bam -t SE -e ./06_rmats/plot/SE.MATS.JC_top5.txt --l1 LF --l2 CF --exon_s 1 --intron_s 1 -o ./06_rmats/plot/ &
參數：
--b1 B1：sample_1 in bam format (s1_rep1.bam[,s1_rep2.bam])
--b2 B2：sample_2 in bam format (s2_rep1.bam[,s2_rep2.bam])
-t：rMATS結果中產生的可變剪切類型 {SE,A5SS,A3SS,MXE,RI}
-e EVENTS_FILE：The rMATS output event file (Only if using rMATS format result as event file) 在*.MATS.JC.txt文件里把需要畫圖的基因信息提取出來
-c：需要畫圖展示的基因的位置信息，基因組區域的坐標和注釋，gff3文件，-c {chromosome}:{strand}:{start}:{end}:{/path/to/gff3}
--l1 L1：The label for first sample
--l2 L2：The label for second sample
-o OUT_DIR：The output directory
--exon_s 1：縮小外顯子的大小。默認值為1
--intron_s 1：縮小內含子的大小。例如，如果--intron_s為5，表示內含子的大小為5:1（如果內含子的實際大小是5，那么就將縮小為1）。默認值為1。
--group-info：如果用戶想要將樣本分組，可以使用* .gf文件指定此參數
--color：可以使用自定義繪圖的顏色序列。顏色的數量應該與bam_files對應
--font-size：更改字體大小，默認等于8
--no-text-background：透明文本背景
--hide-number：隱藏連接數
--min-counts 0：用于指定展示的最小count數，如果實際的counts數小于該閾值，則不會在圖中顯示。
結果：
圖上方標題為：可變剪接事件3個外顯子所在的基因組坐標及正負鏈信息。
跨外顯子比對的 reads 使用連接外顯子 junction 邊界的弧線表示。弧線的粗細和比對到 junction 上的 reads 數成正比，同時弧線上的數字指出了 junction reads 的數目。
右上方標注了各個樣本可變剪接事件所在的基因及IncLevel（最終會用這2個值做組間的差異AS分析）。
最下方為根據gtf推斷出的選擇性剪接異構體。
