詳細介紹最新版可變剪接軟件rMATS

作者：椰子糖
審稿：童蒙
編輯：amethyst

可變剪切能夠產生多種類型的mRNA，因此一個基因就可以產生多種不同的蛋白。這個過程極大的增加了mRNA和蛋白質的多樣性。可變剪切（alternative splicing）是一種后轉錄生物學過程，對細胞活動和疾病過程具有重要的且廣泛的影響。研究表明人的基因組中有超過90-95%的多外顯子基因存在可變剪切。到目前為止，也有很多軟件可對其進行檢測，今天我們就來了解一下這款常用可變剪切軟件rMATS的最新版詳情。

1. 軟件介紹

rMATS是檢測可變剪切事件的常用軟件之一，其可以從RNA測序數據中，檢測出多種類型的可變剪切事件，并提供了定量和組間差異分析的功能，可對生物學重復的樣本進行組間分析。2020年6月更新的4.1版中更是對軟件功能進行了完善：

1. 添加參數--task、--tmp等，以在不同的計算機上運行部分計算；
2. 添加參數--variable-read-length，能夠允許不同長度的長度的reads進行分析；
3. 添加參數--paired-stats，進行成對統計分析；
4. 添加參數--novelSS, --mil, --mel，以檢測新發可變剪切；
5. 輸出文件中用fromGTF.novelJunction 和 fromGTF.novelSpliceSite 代替 fromGTF.novelEvents；
6. 版本兼容了python2和python3；
7. 在僅一個樣本的組別或僅一個組別時，務必添加參數--statoff；
8. 修改了部分之前版本的bug。

軟件網頁鏈接：http://rnaseq-mats.sourceforge.net/

其檢測的可變檢測的事件類型如下：

2. 軟件安裝

rMATS turbo是rMATS的C/Cython版本。主要的差別在于速度和存儲資源上，相比較rMATS turbo要快100倍，輸出文件要小1000倍。具體可以參考文檔：https://github.com/Xinglab/rmats-turbo/blob/v4.1.0/README.md，因此我們安裝rMATS turbo。

安裝依賴：Python (either 2.7 or 3.6),BLAS,LAPACK,GNU Scientific Library,GCC,gfortran,CMake等。保證以上依賴均存在的情況下就可以進行安裝了。其實安裝好conda，這些基礎的包均已包括了。

conda create --name py2 python=2.7
conda activate py2
conda install -c bioconda rmats

安裝好以后就可以進行軟件測試啦。

3. 軟件使用及測試

參數說明:

python rmats.py -h
usage: rmats.py [options]
optional arguments:
 -h, --help            show this help message and exit
 --version             show program's version number and exit
  --gtf GTF             An annotation of genes and transcripts in GTF format
 --b1 B1               A text file containing a comma separated list of the
                        BAM files for sample_1. (Only if using BAM)
 --b2 B2               A text file containing a comma separated list of the
                        BAM files for sample_2. (Only if using BAM)
  --s1 S1               A text file containing a comma separated list of the
                        FASTQ files for sample_1. If using paired reads the
                        format is ":" to separate pairs and "," to separate
                        replicates. (Only if using fastq)
  --s2 S2               A text file containing a comma separated list of the
                        FASTQ files for sample_2. If using paired reads the
                        format is ":" to separate pairs and "," to separate
                        replicates. (Only if using fastq)
  --od OD               The directory for final output
  --tmp TMP             The directory for intermediate output such as ".rmats"
                        files from the prep step
  -t {paired,single}    Type of read used in the analysis: either "paired" for
                        paired-end data or "single" for single-end data.
                        Default: paired
  --libType {fr-unstranded,fr-firststrand,fr-secondstrand}
                        Library type. Use fr-firststrand or fr-secondstrand
                        for strand-specific data. Default: fr-unstranded
  --readLength READLENGTH
                        The length of each read
  --variable-read-length
                        Allow reads with lengths that differ from --readLength
                        to be processed. --readLength will still be used to
                        determine IncFormLen and SkipFormLen
  --anchorLength ANCHORLENGTH
                        The anchor length. Default is 1
  --tophatAnchor TOPHATANCHOR
                        The "anchor length" or "overhang length" used in the
                        aligner. At least "anchor length" NT must be mapped to
                        each end of a given junction. The default is 6. (Only
                        if using fastq)
  --bi BINDEX           The directory name of the STAR binary indices (name of
                        the directory that contains the SA file). (Only if
                        using fastq)
  --nthread NTHREAD     The number of threads. The optimal number of threads
                        should be equal to the number of CPU cores. Default: 1
  --tstat TSTAT         The number of threads for the statistical model.
                        Default: 1
  --cstat CSTAT         The cutoff splicing difference. The cutoff used in the
                        null hypothesis test for differential splicing. The
                        default is 0.0001 for 0.01% difference. Valid: 0 <=
                        cutoff < 1. Does not apply to the paired stats model
  --task {prep,post,both,inte}
                        Specify which step(s) of rMATS to run. Default: both.
                        prep: preprocess BAMs and generate a .rmats file.
                        post: load .rmats file(s) into memory, detect and
                        count alternative splicing events, and calculate P
                        value (if not --statoff). both: prep + post. inte
                        (integrity): check that the BAM filenames recorded by
                        the prep task(s) match the BAM filenames for the
                        current command line
  --statoff             Skip the statistical analysis
  --paired-stats        Use the paired stats model
  --novelSS             Enable detection of novel splice sites (unannotated
                        splice sites). Default is no detection of novel splice
                        sites
  --mil MIL             Minimum Intron Length. Only impacts --novelSS
                        behavior. Default: 50
  --mel MEL             Maximum Exon Length. Only impacts --novelSS behavior.
                        Default: 500

單個樣本運行時

將NA12878的bam文件的具體路徑寫入到/path/to/b1.txt文件中

condadir/envs/py2/bin/python condadir/envs/py2/rMATS/rmats.py --nthread 4 --b1 /path/to/b1.txt --gtf Homo_sapiens.hg19_ucsc.gtf --od NA12878 -t paired --readLength 101 --libType fr-unstranded --statoff

--b1 為bam文件的路徑，若有生物學重復則bam文件路徑用逗號隔開，為單比較組時，僅給b1或者給s1即可；
--gtf 為已知的基因及轉錄本的gtf文件；--od 即為輸出路徑；-t 測序類型為單端或者雙端 ;
--readLength 每條reads的長度，若長度不一致時，可使用--variable-read-length參數與readLength結合使用將reads截取到給定的數值；--libType 文庫類型，可選擇是否為鏈特異性；
--statoff 加上該參數則跳過統計部分，單樣本或者單比較組時，跳過統計步驟。

比較組運行時

##/path/to/b1.txt
/path/to/1_1.bam,/path/to/1_2.bam
##/path/to/b2.txt
/path/to/2_1.bam,/path/to/2_2.bam
python rmats.py --b1 /path/to/b1.txt --b2 /path/to/b2.txt --gtf /path/to/the.gtf -t paired --readLength 50 --nthread 4 --od /path/to/output --tmp /path/to/tmp_output --paired-stats

--b1 為組別1的bam文件的路徑，若有生物學重復則bam文件路徑用逗號隔開，為單比較組時，僅給b1或者給s1即可；
--b2 為組別2的bam文件的路徑，若有生物學重復則bam文件路徑用逗號隔開；
--gtf 為已知的基因及轉錄本的gtf文件；
--od 即為輸出路徑；
-t 測序類型為單端或者雙端 ;
--readLength 若長度不一致時，可使用該參數將reads截取到給定的數值；
--libType 文庫類型，可選擇是否為鏈特異性；
--tmp 暫存目錄；
--paired-stats 使用成對統計模型。

除了bam文件可作該軟件的輸入外，還可以使用fq文件做為輸入，使用-s1和-s2參數即可，同一樣本的雙端reads使用冒號分隔，生物學重復間使用逗號分隔。

4. 結果說明

每一種可變剪切事件有相關的一系列的輸出文件，每一種事件的相關文件以事件名作為前綴之一，以下文件中以[AS_Event]代替了[SE (skipped exon)，MXE (mutually exclusive exons)，A3SS (alternative 3' splice site)，A5SS (alternative 5' splice site)，RI (retained intron)] 中各事件：

  • [AS_Event].MATS.JC.txt：檢出的junction區域的reads數（Junction Counts）；
  • [AS_Event].MATS.JCEC.txt：檢出的junction區域的reads數（Junction Counts）和不跨越的外顯子上read數（Exon Counts），考慮已知可變剪切事件時，可重點參考這個文件；
  • fromGTF.[AS_Event].txt：從RNA和GTF中檢出的所有可變剪切事件；
  • fromGTF.novelJunction.[AS_Event].txt：僅使用RNA鑒定的可變剪切事件，與gtf的分析分離，其中并不包含未注釋的可變剪切位點；
  • fromGTF.novelSpliceSite.[AS_Event].txt：文件中僅包含未知的可變剪切位點的可變剪切事件，僅使用--novelSS參數時產生該文件；
  • JC.raw.input.[AS_Event].txt：[AS_Event].MATS.JC.txt文件的input raw文件；
  • JCEC.raw.input.[AS_Event].txt：[AS_Event].MATS.JCEC.txt文件的input raw文件。

01. 事件文件中共同的屬性列

ID：rMATS 事件的ID；
GeneID：Gene ID；
geneSymbol：Gene 名稱；
chr：染色體；
strand：基因的正負鏈情況；
IJC_SAMPLE_1：sample 1中包含剪切區域的reads數，生物學重復以逗號分隔；
SJC_SAMPLE_1：sample 1中不包含剪切區域的reads數，生物學重復以逗號分隔；
IJC_SAMPLE_2：sample 2中包含剪切區域的reads數，生物學重復以逗號分隔；
SJC_SAMPLE_2：sample 2中不包含剪切區域的reads數，生物學重復以逗號分隔；
IncFormLen：包含區域的長度，用于校正；
SkipFormLen：跳過區域的長度，用于校正；
PValue：兩個比較組可變剪切差異的顯著性（僅在使用statistical model時存在）；
FDR：由 p-value計算的錯誤發現率（僅在使用statistical model時存在）；
IncLevel1：由校正后reads數得到的sample 1的區域等級，生物學重復以逗號分隔；
IncLevel2：由校正后reads數得到的sample 2的區域等級，生物學重復以逗號分隔；
IncLevelDifference：average(IncLevel1) - average(IncLevel2)。

02. 事件文件中特異的屬性列

  • SE：exonStart_0base，exonEnd，upstreamES，upstreamEE，downstreamES，downstreamEE
    包含形式中的目標外顯子（該外顯子的起始位置, 終止位置）
  • MXE：1stExonStart_0base，1stExonEnd，2ndExonStart_0base，2ndExonEnd，upstreamES，upstreamEE，downstreamES，downstreamEE
    +鏈，包含形式是包含第1個外顯子（外顯子的起始位置, 終止位置），跳躍第2個外顯子
    -鏈，包含形式是包含第2個外顯子（外顯子的起始位置, 終止位置），跳躍第1個外顯子
  • A3SS, A5SS：longExonStart_0base，longExonEnd，shortES，shortEE，flankingES，flankingEE
    包含形式中使用長外顯子（長外顯子的起始位置, 終止位置）代替短的外顯子（短外顯子的起始位置 ，終止位置）
  • RI：riExonStart_0base，riExonEnd，upstreamES，upstreamEE，downstreamES，downstreamEE
    包含形式中包含內含子區域一般使用（上游外顯子的終止位置 , 下有外顯子的起始位置）

5. 總結

總體上說目前rMATS4.1版不受限于單雙端測序，reads長度不一，是否存在生物學重復，是否有比較組，是否需要檢測新轉錄本，是否鏈特異性等條件，并且其可以進行分步，分機器計算，功能完善，主要可變剪切事件檢測完整的一款軟件。在二代測序可變剪切檢測的軟件中可以算佼佼者，希望小編的介紹能給大家的可變剪切分析帶來幫助。

6. 參考文獻

  • Mehmood A , Laiho A , Venlinen M S , et al. Systematic evaluation of differential splicing tools for RNA-seq studies[J]. Briefings in Bioinformatics, 2019.
  • Shen S , Park J W , Lu Z , et al. rMATS: Robust and flexible detection of differential alternative splicing from replicate RNA-Seq data[J]. Proc Natl Acad Sci U S A, 2014, 111(51):5593-601.
  • Park J W , Tokheim C , Shen S , et al. Identifying Differential Alternative Splicing Events from RNA Sequencing Data Using RNASeq-MATS[M]// Deep Sequencing Data Analysis. Humana Press, 2013.
  • Shihao S , Won P J , Jian H , et al. MATS: a Bayesian framework for flexible detection of differential alternative splicing from RNA-Seq data[J]. Nucleic Acids Research, 2012(8):e61.
  • http://rnaseq-mats.sourceforge.net/
  • https://github.com/Xinglab/rmats-turbo/blob/v4.1.0
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