1. 建立項目團體
多機構合作，數據和利益共享。
2. 收集目標基因組信息
考慮的因素：
基因組大小、倍性、雜合性、GC含量和重復。
數據庫查詢：
fungi (http://www.zbi.ee/fungalgenomesize)
animals (http://www.genomesize.com)
plants (http://data.kew.org/cvalues)
估計：
流式細胞儀和kmer頻率分布（建議兩種都用）。
3. 設計最佳實驗流程
高質量染色體水平的參考基因組是關鍵。
質控：reads長度、錯誤率、深度、覆蓋度、文庫等。
有錢：PacBio/ONT + Hi-C
沒錢：Illumina/10X GC(genomics chrominum) + Hi-C
從頭組裝：一般是完全denovo。
參考基因組輔助：利用近緣物種作為參考和指導進行組裝，該方法對數據和計算量較小，但是現有參考基因組可能有錯誤和重排。
目的：構建一致的單倍型或定相單倍型的染色體水平組裝。一般的組裝是將2條序列整合為1個單倍型，因此不能得到二倍體信息。
選擇合適的工具和流程：考慮組裝的質量和連續性，包括速度和敏感性。
三代組裝工具網站：
LRS-DB https://long-read-tools.org/
常用的組裝工具軟件：
4. 選擇最佳測序平臺和準備文庫
文庫制備的兩個考慮：目標基因組大小、測序樣本數。
reads： 短(Illumina, 454, SOLiD, MGI, Ion Torrent)，長(ONT and PacBio)或混合(hybrid) read
5. 選擇最佳DNA來源和提取方法
不含雜質。
最低量要求：
Illumina 和 10xGC > 3 ng, PacBio > 20 μg, ONT > 1 μg, BioNano > 200 ng, Dovetail > 5 μg 。
三代平均DNA長度>25 kb。
使用核與細胞器DNA比率更高的組織。
純化DNA的測量/定量可使用分光光度法和基于熒光的方法。
6. 檢查計算資源與要求
數據量、基因組大小、雜合率和倍性等對內存
需求、CPU數量和計算成本成幾何增加。
可選擇云計算合理分配。
7. 選擇最佳計算設計和流程
三種選擇：
（1）最大化內部員工或協作
（2）從服務外包提供者
（3）模擬具有不同設置的數據
8. 基因組組裝
推薦的基因組組裝和注釋流程圖：
強烈建議使用BioNano和Hi-C數據來達到染色體級組裝，因為這兩種方法可通過驗證初始組裝的完整性，糾正方向錯誤，排序scaffolds來完善結果。
9. 在注釋前檢查組裝質量
在鳥槍法時代，denovo依賴于于算法和試驗設計。reads長度、文庫大小、reads準確性和基因組復雜性等決定了組裝的準確性和連續性。
質量評估：
- 組裝大小
- 組裝連續性（N50，NG50，NA50，NGA50）
- 重疊群contig數目和（平均）長度
- 組裝可能性得分（通過reads比對每一個候選組裝來計算）
- 組裝完整度（BUSCO得分或RNAseq mapping）
- 其他：QTL、ESTs、熒光原位雜交、BAC克隆、染色體水平遺傳圖譜。
三個最重要的指標：連續性、準確性、完整性。
方法：三代/10XGC，BioNano，Hi-C數據；軟件LR_Gapcloser。
10. 基因組注釋
注釋內容：
- 識別非編碼區：重復序列、轉座子。
- 識別編碼區（稱為基因預測）：內含子、外顯子、CDS、5/3 UTR。
- 附加這些元素的生物學信息。
注釋的方法：
- 手動注釋：耗時昂貴，需要獲得準確的基因模型和基因集。
- 自動注釋：置信度和可靠性低（通常基于直系同源物種，不同數據庫數據不同）。
- 半自動注釋：集成不同的結果獲得一致的注釋，平衡了手動和自動方法。
結合比對EST、RNAseq、蛋白序列作為外部基因組組裝證據。
結合方法和結果（尤其是MAKER，BRAKER和String-Tie）可以有效地提高注釋預測的數量和準確性（尤其是對孤兒基因和其他年輕基因）。
功能注釋GO等。
在線基因組注釋工具：
命令行注釋工具：
非編碼RNA注釋：
重復序列注釋：
11. 建立一種可查詢和可共享的輸出格式
公共數據庫 or 自建數據庫？
12. 分發社區來優化組裝和注釋
不同版本軟件結果不同，為確保穩定，數據可重復，需持續維護和更新。
植物社區示例：
https://nbenth.com/annotator/index,
https://solgenomics.net
https://www.helmholtz-muenchen.de/pgsb
動物社區示例：
http://www.slimsuite.unsw.edu.au/servers/apollo.php
https://bovinegenome.elsiklab.missouri.edu
http://www.gmgi.org/genomics-fish-shellfish
https://www.sanger.ac.uk/science/data/vertebrate-genomes-sequencing
對于初學者的基因組組裝和注釋流程的建議
不建議純二代組裝。
純三代或混合組裝方法：
此文太多廢話，慎讀~~~
