寫在前面（19.11.14，11.19）
最近需要寫一份博士研究計(jì)劃，感覺最近單細(xì)胞RNA-seq（scRNA-seq）和單細(xì)胞ATAC-seq（scATAC-seq）聯(lián)合分析很火，想著在碩士研究的基礎(chǔ)上蹭一下熱度，單細(xì)胞水平達(dá)不到，可以用bulk cells嘛。 但是，作為一個(gè)生信小白，怎么才能寫出一篇看起來是那么回事的研究計(jì)劃呢？ 之前在jimmy大神的生信技能樹中看過很多關(guān)于ATAC-seq數(shù)據(jù)分析的文章，對理論知識(shí)和流程有所了解，但是就是處于光說不練瞎把式的狀態(tài)，所以只能硬著頭皮比著葫蘆畫瓢看看怎么寫。 詳細(xì)信息可以參見生信技能樹的實(shí)操系列教程目錄
ATAC-seq指南
意外的發(fā)現(xiàn)
在google一下的時(shí)候，突然發(fā)現(xiàn)了Harvard FAS的一篇文章 ATAC-seq Guidelines，感覺這篇文章講的框架非常好，比較適合我這種急功近利對ATAC-seq做一個(gè)全面了解的人，因此我特地把我的一些收獲寫出來。不是單純的翻譯，只是記錄一些學(xué)習(xí)過程。 ##ATAC-seq 概況 我的理解：基因在進(jìn)行調(diào)控時(shí)，其上游染色質(zhì)是屬于開放的狀態(tài)，探究這種開放的情況可以獲得該狀態(tài)下整體的基因調(diào)控情況。T5轉(zhuǎn)座酶是可以插入到開放的區(qū)域并切割DNA片段，因此將T5轉(zhuǎn)座酶連接上特異性的 adapters，再將片段收集測序，就能得到全基因度尺度上處于開放狀態(tài)的染色質(zhì)區(qū)域。詳細(xì)知識(shí)參考ATAC-seq基礎(chǔ)知識(shí) 文獻(xiàn)：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC4374986/
實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)
一些注意事項(xiàng)：（太長不看版）
重復(fù)：一般兩個(gè)足夠。
對照：一般不用，可以使用不加轉(zhuǎn)座酶，然后加上接頭的片段化DNA。
PCR擴(kuò)增：建庫過程中少進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可能會(huì)影響后續(xù)分析。
測序深度：取決于基因組大小和染色質(zhì)開放程度，人類樣本5千萬reads。
測序模式：推薦雙端測序。
線粒體：最好去除，方法見 Omni-ATAC method
一些注意事項(xiàng)：（婆婆媽媽版）
重復(fù) 重復(fù)可以確保你的樣品產(chǎn)生的數(shù)據(jù)是由生物效應(yīng)引起的，而不是某個(gè)特定樣本的特性或其處理過程造成的。 （這里我想到一個(gè)問題，像我研究的真菌是含有細(xì)胞壁的，酶解是去除細(xì)胞壁而又不傷害細(xì)胞核的方法，可以方便后續(xù)提取細(xì)胞核，但是酶解對細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生一定的影響，尤其是如果實(shí)驗(yàn)處理就是溫度處理的話，估計(jì)影響會(huì)很大。）
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對照
我的理解就是，分析的時(shí)候就可以把沒有處理的作為對照，似乎不太需要單獨(dú)做一個(gè)純陰性對照。
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PCR擴(kuò)增
主要是關(guān)于PCR重復(fù)的問題，關(guān)于為什么會(huì)產(chǎn)生重復(fù)，重復(fù)會(huì)對后續(xù)分析產(chǎn)生哪些影響？
可以參考以下幾篇文章，都很有趣，值得學(xué)習(xí)。
How PCR duplicates arise in next-generation sequencing、試論NGS數(shù)據(jù)的Duplication問題 關(guān)于二代測序中的duplication 、如何去除二代測序數(shù)據(jù)中的PCR duplication才科學(xué)？
我的理解就是建庫加接頭或者儀器讀取過程中會(huì)產(chǎn)生PCR重復(fù)，而重復(fù)會(huì)對Peak calling產(chǎn)生影響，因此需要去除。
在 Genrich 中，-r 可以進(jìn)行PCR重復(fù)的移除。
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測序深度：
暫時(shí)不知道咋寫
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測序模式：
雙端測序的優(yōu)勢：
1）有助于提高重復(fù)序列比對的準(zhǔn)確性，參見 單端測序與雙末端測序問題- 簡書 ， [序列拼接] 雙端測序，原理+ 拼接（Pandaseq） - 知乎
2）雙端測序可以獲得更多的關(guān)于轉(zhuǎn)座酶插入位置的信息。
3）單端測序中只要5‘ 端一樣就會(huì)被認(rèn)定為duplication，會(huì)產(chǎn)生假陽性的結(jié)果，也有可能去除了不該去除的序列，而雙端測序避免了這種情況。
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線粒體：
ATAC-seq 中含有很大一部分線粒體DNA，參見this discussion
而我們關(guān)注的只是核DNA，因此要對線粒體DNA進(jìn)行去除，一般可以從實(shí)驗(yàn)方法和分析方法兩個(gè)方面進(jìn)行去除（同時(shí)進(jìn)行）。
實(shí)驗(yàn)方法去除可參見：Omni-ATAC method 、ATAC-seq Assay with Low Mitochondrial DNA Contamination from Primary Human CD4+ T Lymphocytes、 using CRISPR to reduce mitochondrial contamination
分析方法：Genrich中可以使用
-e chrM命令來去除線粒體的reads
總結(jié)
分析部分后續(xù)再寫吧，還打算以一篇文章進(jìn)行實(shí)戰(zhàn)Chromatin Accessibility-Based Characterization of the Gene Regulatory Network Underlying Plasmodium falciparum Blood-Stage Development 另外，該指南還有一個(gè)舊版本，還沒仔細(xì)看，目前新版本分析Peak-caliling中沒有使用Macs2，而是用的Genrich，走M(jìn)acs2流程的話請參見老版本。
