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分兩個部分進行介紹：
1.介紹外顯子測序的技術方法
2.介紹外顯子測序可以得到哪些有用的生物信息
一、外顯子測序的技術方法
1.1實驗原理
外顯子測序的核心技術是針對人外顯子序列設計的捕獲探針庫，這些探針的序列，都和人外顯子的DNA序列相互補。在實驗過程中，它可和人的外顯子DNA序列進行雜交結合。同時，這些探針都標上了生物素。有了這個捕獲試劑盒，就可以進行建庫和捕獲了。
第一步，是先把基因組DNA進行超聲打碎，建成DNA文庫。
第二步，是把建好的文庫和探針庫進行雜交
雜交過程中，通過核酸序列的互補結合的原理，探針會和目標DNA片段進行結合。再用結合了鏈霉親和素的磁珠，與這個雜交混合液吶進行混合。
因為鏈霉親合素會和生物素牢固結合。這樣，就把我們要捕獲的外顯子目標片段，通過探針，間接地結合到了磁珠上。然后，通過磁鐵把這些磁珠給吸附下來。
而把上清液吶給去掉，也就把沒有結合的DNA片段給洗掉了。接下來，用洗脫液，把我們要的DNA文庫從磁珠上給洗脫下來。那么這些文庫吶，再經過PCR擴增，就可以上HiSeq測序儀進行測序了。測完序以后，就可以進行生物信息學的處理了。
1.2數據分析
先是把這些測序的DNA片段比對到人的基因組上，再把這些比對到基因組的序列進行突變分析。
覆蓋深度
一般用Agilent SureSelect 50M的試劑盒進行外顯子建庫、捕獲。再用HiSeq 2500 V4 PE125的方法進行測序，測10個G的數據量。大約可以得到95X的“有效測序深度”。我們說的有效測序深度（effective sequencing depth）是相對于總測序深度來說的。
總的測序深度吶，是把所有測得的數據（量）去除以目標區域的大小。舉例來說，用Agilent 50M的這個試劑盒，我們測到10個G的數據。去除以目標區域的50M的大小，那么得到的是200X的測序深度（10G/50M = 200X）。但是這個200X的測序深度，對于做生物信息學分析來說吶，并沒有太大的實在意義。因為當中還要扣掉許多無用的數據，才能得到有效的數據。
在外顯子測序中，要扣掉4種因素引起的無效數據。
- 第一個影響因素：雜交捕獲的過程它不是十分精確的，基因組中的有許多序列，是和外顯子有一定的同源性的。那么這些片段吶，在雜交過程當中，也會被雜交捕獲下來。而這些片段吶，不是基因的外顯子。所以，我們在分析過程當中，首先要把這些序列給去除掉。
- 第二個影響因素，是捕獲下來的一個片段，很可能它(只有）一部分的序列是落在目標區域還有一部分序列吶，是突出在目標范圍之外的。那么，這部分突出來的序列吶，它不是目標區域，所以，它也不計入外顯子測序的“有效測序深度”。
這個落在目標區的數據，占全部被測到的數據的比例，我們用一個專業術語來稱乎它，叫作捕獲效率(capture efficiency)。那么AgilentSureSelect這個試劑盒吶，它的捕獲效率，大約是65~70%。
- 第3個影響因素：是Duplication。就是建庫過程當中它的最后一步，是通過PCR擴增把原始的模板，擴增出幾百倍來。那么由同一個模板分子擴增出來的子文庫分子，是長得一模一樣的那么這些多出來的這些分子，如果被重復地測到它并不能為我們提供太多有用的生物信息。所以，我們在生物信息分析的過程當中，我們要去掉這些重復的片段。那么要去掉這些重復的片段我們判斷的依據是：2個DNA分子它們的5'起始位置、和3'的結束位置，完全一模一樣，那么我們就認定這2個分子，是從同一個母分子，PCR出來的（2個）子分子。
然后，我們會比較這2個序列的數據質量，留下那個數據質量比較高的，去掉那個數據質量比較低的，這也就是我們通常所說的“去Duplication"的過程。用Agilent SureSelect試劑盒進行建庫、捕獲，實測10個G的數據，我們發現duplication大約在5%左右。duplication的比例不是恒定不變的。而是會隨著測序深度的增加、而增加，因為上機（測序）的文庫是經過PCR擴增的文庫。隨著測序量增大，那么測到源自同一個模板的PCR子分子的概率吶，就會提高。
- 第4個影響因素：是目前主流的測序方法是HiSeq V4 PE125。也就是：雙端各測125個堿基，那么Agilent的建庫方法中當吶，插入片段是150~200BP，這樣一個大致范圍的這些片段，那么它的平均片段長度吶，是180BP。那么我們用雙端125的方法來測序就會導致左邊的這個reads（序列）和右邊的這個reads（序列），讀到當中，會有一段，大概會有70BP的交疊。
那這個70BP的交疊的序列，是冗余的序列。也就是說，我們讀了250個BP的序列，但是其中大約有效的呢，是180個（BP）。有70個BP吶，是冗余的。
綜合上述4項因素，我們可以看到，用AgilentSureSelect 50M的這個捕獲試劑盒進行建庫、捕獲，并且用HiSeq V4 PE125的測序方法來測序，測10個G的數據量，那么可以得到，大約95X的有效測序深度，（10 * 0.7 * 0.95 * 180 / 250 / 50 = 95）。
覆蓋均勻性
除了測到的有效數據量之外，還有一個因素會影響到后面的分析，這就是Reads的分布均勻情況，也就是說目標區域的每個堿基被覆蓋的深度的均勻性。那么這個結果吶，是越均勻越好。
科學家經過實測，發現Agilent的SureSelect、和Roche的Nimblegen，這兩個捕獲試劑盒，所得到的覆蓋均勻性是比較好的。
1.3 外顯子測序在腫瘤測序中的優勢
外顯子測序，可以測Germline突變（胚胎形成時就帶有的突變），也可以測體細胞突變（Somatic Mutation），但隨著Illumina推出HiSeq X10測序儀，把人全基因組測序的直接成本降到1000美元以下，那么Germline水平的突變吶，已經很少用外顯子來測了。目前，外顯子測序的主要優勢就體現在腫瘤基因測序方面，之所以外顯子測序在腫瘤基因測序方面有優勢是因為外顯子測序，它的測序深度，可以比較容易地做到“深度”測序。它可以比較輕易地達到100X、200X，甚至更深的測序深度。這就有利于測到 low allele frequency （低等位基因頻名優新）的體細胞突變。因為腫瘤中的突變吶，往往都是 low allele frequency 的體細胞突變。所以，外顯子組測序就在測腫瘤基因組突變方面，顯出比較明顯的優勢來。
那么如果是要測腫瘤中的體細胞突變吶，一般是拿手術切下來的腫瘤組織DNA、和病人外周血中的白細胞基因組DNA，進行外顯子測序。一般腫瘤的測100~200X的深度，白細胞的（DNA）測100X的深度。從白細胞DNA得到這個病人的Germline基因組序列，拿腫瘤的DNA序列與之做對比，找出其中的體細胞突變。
二、外顯子測序可以得到哪些有用的生物信息
2.1SNP信息
外顯子組測序，主要能夠得到的信息是點突變，也就是SNP信息，和插入缺失突變，也就是Indel信息。這張圖就是找到的體細胞突變的泡泡圖。在這個泡泡圖中，突變頻率越高的基因，就畫一個大泡泡，放在圖的中間。突變頻率低一點的基因，就畫一個相對小一點的泡泡，延著逆時針排列。再低頻的突變，再畫一個再小的泡泡，再在外面再排列下去。依此類推，就得到這樣一個泡泡圖。
泡泡圖有利于我們非常直觀地看到樣本中體細胞突變的情況。
2.2GO 和 Pathway 分析
找到突變之后，就可以進一步地做GO和Pathway分析。這張圖是GO分析的結果。
這是根據突變的點在腫瘤中的富集的情況做的分析。分成“細胞組件”、“分子功能”、和“生物過程”3個大類，進行展示。柱子越高，則表示這個亞類當中突變越多。
這是有向無環圖，它把突變進一步一步富集到更精細的小概念當中進行展示。
這個圖中，是越向下，它的功能就劃分得越精細。同時顏色越深的塊塊，則表示突變在這個小概念中富集程度越高。
這是Pathway的KEGG富集分析。它吶，可以幫助我們看到哪些通路發生了顯著的變化。
更深一步的分解分析，則讓我們深入地看到突變的基因在整個通路中所處的節點。
讓我們更好地探索突變和病變之間的關系，我們要說明：在外顯子測序的數據分析當中，對基因組的結構變異是不敏感的。不敏感的原因是外顯子測序，只測了基因組上很小一部分區域，這個比例小到了只有1~2%，所以當結構變異的斷點，不落在外顯子區域的時侯吶，外顯子測序是看不到這些斷點的，所以我們說：外顯子測序對基因組的結構，變異--SV（Structure Variation）吶，是不敏感的。
2.3對CNV不敏感
外顯子測序對拷貝數變異（CNV，copy numbervariation），不是很敏感。不敏感的原因吶，是因為雜交捕獲過程啊，是一個含了很高偶然性的過程。也就是說，一個外顯子片段上，它有多少個reads(序列)被捕獲下來，樣本和樣本之間是有很大差異的。或者說，它的覆蓋度，本來就是忽高忽低的，因為有這種忽高忽低吶。這就導致：一個外顯子上測到的Reads數變高，或者變低。我們很難判斷，是因為這種偶然性吶，還是因為拷貝數發生了變異。所以，外顯子測序，對于小片段的拷貝數變異，它本身是不敏感的。但是，如果基因組上發生了大片段的拷貝數變異。比如說，長度在5M(5M base pair)以上的片段發生了拷貝數變異。那么外顯子測序是可以發現的，這是因為這樣長的片段當中吶，一般含有多個外顯子。當多個外顯子的測序Reads數都發生了改變，那么，它就會有統計上的顯著性。通過這種統計上的顯著性，我們可以來判斷：基因組上的確發生了拷貝數變異。
因為外顯子組測序對結構變異和拷貝數變異不敏感，所以，在實際的腫瘤基因測序中吶，科學家往往是這樣做的：用全基因測序來找到腫瘤樣本中的結構，變異（SV）和拷貝數變異（CNV），再用來外顯子組測序來找腫瘤樣本中的、低頻的SNP和Indel體細胞突變。
