ATAC-Seq簡介

ATAC-seq（Assay for Transposase-Accessible Chromatin with high throughput sequencing） 是2013年由斯坦福大學(xué)William J. Greenleaf和Howard Y. Chang實驗室開發(fā)的用于研究染色質(zhì)可及性（通常也理解為染色質(zhì)的開放性）的方法， 原理是通過轉(zhuǎn)座酶Tn5容易結(jié)合在開放染色質(zhì)的特性，然后對Tn5酶捕獲到的DNA序列進(jìn)行測序。
真核生物的核DNA并不是裸露的，而是與組蛋白結(jié)合形成染色體的基本結(jié)構(gòu)單位核小體，核小體再經(jīng)逐步的壓縮折疊最終形成染色體高級結(jié)構(gòu)（如人的DNA鏈完整展開約2m長，經(jīng)過這樣的折疊就變成了納米級至微米級的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)而可以儲存在小小的細(xì)胞核）。而DNA的復(fù)制轉(zhuǎn)錄是需要將DNA的緊密結(jié)構(gòu)打開，從而允許一些調(diào)控因子結(jié)合（轉(zhuǎn)錄因子或其他調(diào)控因子）。這部分打開的染色質(zhì)，就叫開放染色質(zhì)，打開的染色質(zhì)允許其他調(diào)控因子結(jié)合的特性稱為染色質(zhì)的可及性（chromatin accessibility）。因此，認(rèn)為染色質(zhì)的可及性與轉(zhuǎn)錄調(diào)控密切相關(guān)。
開放染色質(zhì)的研究方法有ATAC-seq以及傳統(tǒng)的DNase-Seq及FAIRE-seq等，ATAC-Seq由于所需細(xì)胞量少，實驗簡單，可以在全基因組范圍內(nèi)檢測染色質(zhì)的開放狀態(tài)，目前已經(jīng)成為研究染色質(zhì)開放性的首選技術(shù)方法。

ATAC-Seq與ChIP-Seq的異同

ATAC-Seq與ChIP-Seq的不同的是ATAC-Seq是全基因組范圍內(nèi)檢測染色質(zhì)的開放程度，可以得到全基因組范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)可能結(jié)合的位點信息，一般用于不知道特定的轉(zhuǎn)錄因子，用此方法與其他方法結(jié)合篩查感興趣的特定調(diào)控因子；但是ChIP-Seq是明確知道感興趣的轉(zhuǎn)錄因子是什么，根據(jù)感興趣的轉(zhuǎn)錄因子設(shè)計抗體去做ChIP實驗拉DNA，驗證感興趣的轉(zhuǎn)錄因子是否與DNA存在相互作用。ATAC-Seq、ChIP-Seq、Dnase-Seq、MNase-Seq、FAIRE-Seq整體的分析思路一致，找到富集區(qū)域，對富集區(qū)域進(jìn)行功能分析。

• ChIP-Seq是揭示特定轉(zhuǎn)錄因子或蛋白復(fù)合物的結(jié)合區(qū)域，實際是研究DNA和蛋白質(zhì)的相互作用，利用抗體將蛋白質(zhì)和DNA一起富集，并對富集到的DNA進(jìn)行測序。
• DNase-Seq、ATAC-Seq、FAIRE-Seq都是用來研究開放染色質(zhì)區(qū)域。DNase-Seq是用的DNase I內(nèi)切酶識別開放染色質(zhì)區(qū)域，而ATAC-seq是用的Tn5轉(zhuǎn)座酶，隨后進(jìn)行富集和擴(kuò)增；FAIRE-Seq是先進(jìn)行超聲裂解，然后用酚-氯仿富集。
• MNase-Seq是用來鑒定核小體區(qū)域。
  
  An overview of ChIP–seq, DNase-seq, ATAC-seq, MNase-seq and FAIRE–seq experiments

翻譯部分
下面這一部分是對HBC課程中ChIP-Seq Introduction這一節(jié)的介紹，主要包括的ChIP-Seq的實驗設(shè)計和分析方法總體思路。原文鏈接：https://github.com/hbctraining/In-depth-NGS-Data-Analysis-Course/blob/master/sessionV/lessons/01_Intro_chipseq_and_setup.md。

ChIP-Seq Introduction

學(xué)習(xí)目標(biāo)

• 理解ChIP-Seq的實驗設(shè)計

ChIP-Seq簡介

ChIP實驗（Chromatin immunoprecipitation）即染色質(zhì)免疫沉淀，根據(jù)DNA與蛋白質(zhì)相互作用的原理，分離富集與感興趣的蛋白相互作用的DNA。ChIP-Seq即對分離得到的DNA擴(kuò)增測序，然后通過分析得到DNA的富集區(qū)域也稱為peaks，同時可以鑒定過表達(dá)的序列motif以及進(jìn)行功能注釋分析。

ChIP-Seq Overall

下面這一部分將會介紹ChIP-Seq數(shù)據(jù)分析的整個流程，從實驗設(shè)計到產(chǎn)生原始的測序reads，以及到最后的功能富集分析和motif查找。

實驗設(shè)計和文庫構(gòu)建

文庫構(gòu)建包括以下5步驟：

• 蛋白質(zhì)與DNA的交聯(lián)
• 超聲打斷DNA鏈
• 加附有抗體的磁珠用于免疫沉淀
• 解交聯(lián)，純化DNA
• DNA片段大小選擇和PCR擴(kuò)增

富集到的DNA片段只有一部分是真實的信號（感興趣的蛋白結(jié)合的DNA區(qū)域），這個比例取決于number of active binding sites, the number of starting genomes, and the efficiency of the IP.

ChIP-Seq富集序列存在以下特點：

• 開放染色質(zhì)區(qū)域比緊密區(qū)域更易打斷；
• 重復(fù)序列會出現(xiàn)似乎被富集的現(xiàn)象
• 序列在整個基因組上不均勻分布

因此，ChIP-Seq需要有合適的對照組，對照樣本需要滿足以下其中一個條件：

• 沒有IP（input DAN）
• 沒有抗體 ("mock IP")
• 沒有特定的抗體 (IgG "mock IP")

示例數(shù)據(jù)介紹

所用到的示例數(shù)據(jù)是來自于人類胚胎干細(xì)胞系（h1-ESC）中Nanog和Pou5f1（Oct4）兩個轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合圖譜。這兩個轉(zhuǎn)錄因子的功能涉及干細(xì)胞的多能性，該研究的目標(biāo)之一是探究這兩個轉(zhuǎn)錄因子在轉(zhuǎn)錄調(diào)控中單獨(dú)和相互的調(diào)控作用。
兩組重復(fù)，每組重復(fù)包括3個實驗樣本信息，共6個樣本，數(shù)據(jù)分析中只用到了12號染色體的信息。
Nanog IP
Pou5f1 IP
Control input DNA

分析流程

下面這幅圖給出了整個分析流程，和每一步需要的數(shù)據(jù)格式，后面會展開介紹。

分析環(huán)境配置

這個課程提供了示例數(shù)據(jù)和分析代碼，可以參考這里連接他們的服務(wù)器，我沒有連接成功，不知道是不是打開方式不對，大家可以嘗試下，如果連接成功，這一部分就是配置服務(wù)器的環(huán)境，準(zhǔn)備數(shù)據(jù)；如果也連接不上可以用自己的數(shù)據(jù)或者下載公共數(shù)據(jù)。

參考資料：

ATAC-seq：染色質(zhì)開放性測序技術(shù)
Clifford A. et al. Nature review, 2014
HBC課程V : 01-Introduction to ChIP-Seq