引物設計是PCR成功與否的關鍵因素之一。目前已經發(fā)表了上百種引物設計的軟件，該如何選擇這些PCR引物設計軟件呢？此前《Bioinformatics》發(fā)表了一篇題為“Classification and review of free PCR primer design software”的綜述文章，對目前可用的免費PCR引物設計軟件進行分類和回顧性總結。

Primer3

考慮到本文總結的軟件有一半以上是基于Primer3，所以把Primer3本身歸為一個類別。這個開源軟件在20世紀90年代末的發(fā)布可以被認為是一個里程碑式的事件。Primer3的獨特之處在于它為PCR引物設計提供了第一個免費、可靠和通用的工具。為了滿足不同應用的需要，Primer3的設計提供了許多選項來控制引物的位置、大小、GC含量、Tm和產物大小。其經歷過兩次重大修訂，結合其他生物信息學工具，Primer3可用于本文討論的所有PCR應用。

Sanger sequencing

PCR的一個應用是產生Sanger測序所需的大量DNA模板。為了克服Sanger測序技術帶來的有限讀長，這一類的所有軟件都設計了引物對，以產生一個擴增子組覆蓋指定的目標區(qū)域。PrimerZ可根據(jù)基因名稱或Ensembl登錄號，為基因的外顯子和啟動子設計重疊引物；JCVI primer designer允許研究者指定任意的基因組區(qū)域；ExonPrimer（未發(fā)表）需要cDNA和相應的基因組序列作為輸入，將這些序列對齊并設計PCR引物來擴增每個外顯子；MPDP3（未發(fā)表）將序列作為輸入，并設計具有自定義長度的引物對；ConservedPrimers 2.0通過將EST與進化相關的參考基因組對齊來設計內含子克隆引物；PrimerDesign-M針對高度可變的基因組（如HIV序列），基于多重序列比對，在保守區(qū)設計測序引物。

RT-qPCR

RT-qPCR的主要功能是測量基因表達水平。為了實現(xiàn)這一目標，最好是擴增從mRNA產生的cDNA，而不是從被污染的基因組DNA模板上擴增。引物對的選擇應使其中一個引物與基因組水平上不存在的外顯子-外顯子邊界序列相匹配?；蛘撸谠O計引物對時，應將每個引物放在不同的外顯子中，這樣基于基因組序列的產物將包括一個長的內含子序列。Autoprime，Quantprime和Primer-BLAST是為自動設計擴增cDNA但不擴增基因組DNA模板的PCR引物而定制的。此外，Primer-BLAST避免了引物中的單核苷酸多態(tài)性。

SNP detection

SNP可以通過引物引入限制性分析（PIRA）PCR或四引物擴增受阻突變系統(tǒng)（ARMS）PCR檢測。PIRA PCR designer（即PCR designer）搜索所有可能產生人工限制位點的錯配，并使用它們設計引物。除了SNP檢測，PCR designer還可以檢測缺失和插入；PRIMER1是專為ARMS PCR開發(fā)的，它允許用戶輸入目標DNA序列，指定多態(tài)性位點并定義引物和產物大小的標準。

Splicing variant detection

高等真核生物中的大多數(shù)多外顯子基因是選擇性剪接的，這在基因功能和病理過程中具有重要意義。為了研究這一現(xiàn)象，PCR被應用于外顯子剪接事件的檢測和定量。RASE定義了特定擴增剪接異構體的引物設計規(guī)則，并將其整合到RASE自動流程中；PRIMEGENS-V2還通過設計引物對提供幫助，這些引物對可以在存在同源和剪接變異的情況下，獨特地放大單個目標基因。?此外，該軟件設計了多重引物對，可以放大所有剪接和復制基因模型的變異；PrimerSeq通過在設計過程中加入用戶提供的轉錄組配置文件，使其與上述軟件程序不同。PrimerSeq利用用戶提供的RNA-seq數(shù)據(jù)來定義剪接模式，以選擇放置RT-PCR引物所需的合適區(qū)域。

Methylation detection

胞嘧啶甲基化是調節(jié)基因組功能的重要機制。檢測甲基化模式已成為了解基因表達調控和診斷甲基化相關疾病的重要手段。植物在CG、CHG和CHH位點存在胞嘧啶甲基化，而CG甲基化是哺乳動物中唯一存在的形式?；趤喠蛩釟潲}轉化的PCR方法是甲基化檢測的常用技術，如BS-PCR、MS-PCR、COBRA和MSRE-PCR等。MethPrimer預測CG島并設計用于BS-PCR和MS-PCR的引物；BiSearch設計了BS-PCR引物，同時避免了亞硫酸氫鹽處理基因組的錯誤引物；Bisprimer主要是為在植物中進行BS-PCR的研究人員設計的，但它也可用于哺乳動物樣品或其他只有CG甲基化的樣品；與其他工具不同，MSP-HTPrimer在設計甲基化檢測引物對時考慮了全基因組的SNP和重復注釋。MSP-HTPrimer能為BS-PCR、MS-PCR、COBRA和MSRE-PCR分析設計引物。

Microsatellite detection

微衛(wèi)星是常用的分子標記，因為它們的高度多態(tài)性可以作為唯一的識別符。MSATCOMMANDER使用正則表達式模式匹配來定位微衛(wèi)星并設計引物，它允許在其5'端進行引物標記；WebSat允許序列提交、微衛(wèi)星可視化并設計引物進行擴增；QDD被設計用來處理所有的設計步驟，從大量的原始序列開始到定位和設計用于微衛(wèi)星擴增的PCR引物。

Conserved/degenerate primers

在理想情況下，設計PCR引物以擴增所有包含微小變異的模板只需識別保守/相同區(qū)域并從這些保守區(qū)域中選擇非簡并引物。然而，當模板變異程度增加時，保守區(qū)域可能變得過于碎片化，無法設計非簡并引物。在這種情況下，必須使用簡并引物。GeneFisher2和PriFi目的是利用不同生物的同源基因進行多重比對，分離目標生物中的基因。與此相反，HYDEN是為了破譯基因家族而開發(fā)的；Amplicon具有圖形交互界面，允許用戶從多個序列校準文件中查看、編輯和選擇序列；Primaclade和PrimerIdent獲取一個alignment文件，以查找alignment中每個序列的所有引物集；相比之下Gemi和easyPAC取一個alignment文件來構建一個一致序列，然后從這個序列中搜索引物和探針。此外，easyPAC還可以選擇將設計的簡并引物映射到任意數(shù)量的參考文件或可能包含同源基因的整個基因組；最后要提到的一個軟件程序是TOPSI，它設計了一種細菌的多個菌株專門共享的實時PCR引物，用于病原體檢測。

Multiplex PCR and?targeted next generation sequencing

多重PCR是一種有效的方法，通過同時擴增節(jié)省時間和DNA樣本。然而，在為多重PCR設計引物時，還需要考慮其他標準，這包括避免引物二聚化和所有引物之間匹配的引物熔解溫度。MuPlex是基于引物延伸技術為SNP基因分型而開發(fā)的；MultiPLX計算現(xiàn)有PCR引物的相容性評分，并對多重PCR引物進行分組；Oli2go將多個序列作為輸入，為所有序列設計多重引物和探針，其特異性檢查不僅限于單個物種，而且可以在多種物種上進行；MPprimer和PrimerStation設計多重引物組，其擴增子的大小不同，以便通過電泳分離；MCMC-ODPR采用Markov chain Monte Carlo優(yōu)化方法，圍繞單核苷酸多態(tài)性設計多重簡并引物，注重引物的可重復使用性，以降低成本。

在研究與性狀或疾病相關的有限基因組區(qū)域時，Targeted NGS是首選技術。有兩個專門為TargetedNGS開發(fā)的多重PCR軟件程序。MPD接受文件中的基因組坐標列表，并自動設計多重PCR引物，同時避免將引物放在已知變異的位點上；Optimus Primer接受基因組坐標列表或基因列表。它自動設計引物來擴增不同的基因亞型和外顯子。它還分割大的外顯子以保持所需的擴增子大小。MPD和Optimus Primer都將引物匯集成兼容組，以促進多重PCR。

Multifunctional software

PerlPrimer：在輸入序列中找到開放閱讀框(ORF)，圍繞ORF設計引物，并允許用戶在每個引物上附加額外的5'序列以用于克隆目的；(ii) 發(fā)現(xiàn)CG島并設計MS-PCR引物；(iii) 找到內含子/外顯子邊界并設計RT-qPCR引物；(iv) 設計用于Sanger測序的引物。

The PCR Suite：設計Sanger測序引物，并設計包含(i) SNP；(ii)?單個基因的所有外顯子；(iii) cDNA列表中的所有ORF的引物。

BatchPrimer3：(i)?發(fā)現(xiàn)微衛(wèi)星并設計微衛(wèi)星側翼引物；(ii)?設計用于SNP基因分型的單堿基延伸、等位基因特異性和tetra-primer ARMS PCR引物。

jPCR：設計(i)?多重PCR引物；(ii)?保守區(qū)/簡并引物；(iii)?合成包含目標序列的連續(xù)片段的引物（重疊延伸PCR）；(iv)?圍繞微衛(wèi)星的引物。

Primo：設計(i) 基于單個蛋白質或多個蛋白質或核苷酸的保守區(qū)/簡并引物；(ii) 多個引物對，每個引物特異性地擴增一個家族中的一個基因；(iii) 幾個簡并引物，用于擴增一組數(shù)百或數(shù)千個基因中的大多數(shù)基因。目的是讓用戶只用幾個PCR反應就能對選定的一組基因進行基因表達分析；(iv)?用于克隆基因以進行表達研究的引物；(v) 多重PCR引物；(vi)?用于定點突變的引物；(vii) MS-PCR和BS-PCR引物。

Niche applications

除了用于普通PCR應用的軟件外，還有一些為特定應用而設計的程序。RJPrimers發(fā)現(xiàn)轉座因子連接點（基因組中的獨特位點）并設計獨特的引物；PrimerX（未發(fā)表）設計用于定點突變的引物；AcePrimer專門為秀麗隱桿線蟲設計引物；PrecisePrimer設計用于分子克隆的引物，包括基于限制性內切酶、GoldenGate、Gibson和非連接性克?。?b>MultiMPrimer3從微生物中發(fā)現(xiàn)物種特異性重復序列，并自動為這些重復序列設計物種特異性PCR引物，以提高病原體診斷的敏感性；AmplifX（未發(fā)表）除了基本的引物設計功能外，還用一個數(shù)據(jù)庫管理引物。

本文中提到軟件的下載信息：https://pcrprimerdesign.github.io/

特別說明

> 如下軟件不在本文的總結范圍中：商業(yè)公司提供的免費軟件（如PrimerQuest）；引物數(shù)據(jù)庫匯編以前使用的引物；僅制備PCR模板或檢查引物質量或特異性的軟件（如UCSC In-Silico PCR）；僅用于植物PCR的軟件；用于芯片引物設計的軟件。

> 本文發(fā)表于2020年10月，如有未納入的軟件歡迎在留言區(qū)分享。

首發(fā)公號：國家基因庫大數(shù)據(jù)平臺

參考文獻

Guo J, Starr D, Guo H. Classification and review of free PCR primer design software[J]. Bioinformatics, 2020, 36(22-23): 5263-5268.?

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