引物設計——QPCR

一、序列查找

參考漢恒生物技術(shù)文檔

常用數(shù)據(jù)庫

NCBI-GeneBank

Nucleotide

Gene

NCBI不多做介紹。NC表示人類基因組DNA的RefSeq，NM表示mRNA的RefSeq，NP表示蛋白質(zhì)的RefSeq，LncRNA信息我們參考RefSeq數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)，RefSeq數(shù)據(jù)庫中的數(shù)據(jù)參考數(shù)據(jù)，是經(jīng)過人工審核，其數(shù)據(jù)信息可信，注釋全面。RefSeq數(shù)據(jù)庫中LncRNA的命名通常是NR或者XR開頭，后面加數(shù)字，其外顯子信息位置，數(shù)量信息非常完整。

Ensembl

例如，相同的LncRNA，Ensembl數(shù)據(jù)庫中信息往往要比NCBI多很多，特別是轉(zhuǎn)錄本數(shù)量。且數(shù)據(jù)變化非常快且變化會很大，可能昨天瀏覽這個數(shù)據(jù)庫中某個LncRNA只有2個轉(zhuǎn)錄本，隔天再去看的時候，可能就變成3個甚至更多。NCBI就不同，盡管更新頻率也非常的快，但是LncRNA的變化通常很小，轉(zhuǎn)錄本數(shù)量基本不變化，序列變化的可能性也非常的小。

UCSC

UCSC數(shù)據(jù)庫的數(shù)據(jù)更新相對較慢，但有些LncRNA名稱如uc001ylu就需要前往UCSC數(shù)據(jù)庫查詢其序列信息。UCSC Genome Browser可以根據(jù)基因組的位置、基因ID、轉(zhuǎn)錄本等信息進行瀏覽查詢。

高分文獻查找

首先可以根據(jù)文獻獲得目的基因序列

通過閱讀文獻，找到你感興趣的基因，根據(jù)文中提到的該基因在NCBI 中 的ID 號，直接打開http://www.ncbi.nlm.nih.gov ， 在All Databases 后的下拉框中選擇Nucleotide，把基因 ID 號輸入Search 前面的文本框中，點“Search”，就可以找到該基因了。

舉例說明

例如：在2003 年JBC 的文章（Conditional Knock-out of Integrin-linked KinaseDemonstrates an Essential Role in Protein Kinase B/Akt Activation）中出現(xiàn)了“calreticulin(GenBank accession number gi 16151096)”，那么把“16151096”輸入Search 前面的文本框中，點“Search”，就可以找到該基因了（當然包括基因序列等相關(guān)信息），見下圖。

檢索結(jié)果界面如下圖，可以看到GenBank 號為AY047586 的CALR 基因的相關(guān)信息了：

里面有很多基因的信息，再往下是基因的的核酸序列（ORIGIN 之后）：

基因的翻譯區(qū)（CDS）點擊 CDS 即可得到：

下圖標示的褐色區(qū)域序列即為基因的編碼區(qū)序列：

這里需要指出一下，在顯示基因的頁面右下側(cè)有一個LinkOut to external resource，里面是與該基因相關(guān)的鏈接，對于該基因的相關(guān)研究是很有用的：

根據(jù)已經(jīng)獲得的基因的相關(guān)信息進行查找

如果只是知道基因的名字，怎么查序列呢？還是舉例說明，比如研究的基因名稱是人的VEGF 基因，那么怎么在NCBI 中找到它呢？首先打開http://www.ncbi.nlm.nih.gov/在All Databases 的下拉框中選擇Gene，然后在中間的文本框中輸入基因名稱“VEGF”，點擊Search...

搜索結(jié)果如下：

結(jié)果有很條，哪一條是我想要的基因呢？這時候要根據(jù)自己研究的基因所屬物種來選擇，如研究的是人屬（Homo sapiens）的，則點擊第四條。

里面是這個基因的詳細信息，需要指出的是，在NCBI 中，基因有很多別名（Aliases），你得到的基因名和NCBI 中記錄的名稱有可能不一致。比如在這里，VEGFA 是NCBI 中記錄的基因名稱，而它還有很多別名，比如VPF, VEGF（這就是我們要找的基因名稱 ）, MVCD1。

再往下看，可以看到里面可以看到該基因再染色體上的位置，以及基因在轉(zhuǎn)錄時有幾個剪切體等信息。這個基因有很多轉(zhuǎn)錄本（isoform a 到 isoform r），可以看到其的mRNA 的鏈接（如NM_001025366.2）和蛋白質(zhì)的鏈接（如NP_001020537.2 ）

isoform a 到 isoform r 哪個是自己想找的基因呢？這就需要根據(jù)自己查閱的文獻以及在這些基因序列后面的解釋來確定了。如果不清楚，一般選擇眾多mRNA 轉(zhuǎn)錄本中最長的轉(zhuǎn)錄本（longest isoform），即下圖中所標示的isoform a ：

如果要找的基因是第一個序列即isoform a, 就可以點擊NM_001025366.1，得到如下基因的信息界面：

然后點擊左上方基因全稱下面的FASTA即可下載該序列。

二、引物設計原則

上述原則不一定需要全部遵循，一般根據(jù)引物設計工具擇優(yōu)選擇，具體設計還需要考慮以下情況：

跨外顯子設計跨外顯子設計的目的就是避免基因組的污染，跨外顯子設計有兩種辦法：

? (1)正向F引物和反向R引物落在不同的外顯子上：

此處注意：（a）如果產(chǎn)物大小允許，正向F引物和反向R引物可以落在不同的外顯子上；（b）如果正向F引物和反向R引物只能落在兩個相鄰的外顯子上，那優(yōu)先選擇內(nèi)含子最大的兩個外顯子上。

? (2)正向引物或者反向引物跨了兩個外顯子：

此處注意：（a）如果能選擇（1）就不要選擇（2）方法設計，（2）設計方法引物位置受限，設計得到的引物參數(shù)可能不是最優(yōu)。（b）如果選擇（2）方法設計，那跨兩個外顯子的引物的3端序列不要跨第二個外顯子太多序列，建議不要超過6個堿基，否則就相當于沒有跨外顯子設計。

特異性比對

從上述數(shù)據(jù)庫中查到該序列信息后，建議先使用NCBI進行比對，簡單做一個核苷酸比對和基因組比對。核苷酸比對的目的是看看這條序列有沒有與NCBI RefSeq同源性較高的序列信息。如果有，可能涉及到需要判斷他們是否是同一條基因的問題。基因組比對的目的是簡單判斷其外顯子個數(shù)組成。

引物位置

引物盡量不要落在LncRNA序列兩端100bp序列以內(nèi)，原因是防止兩端序列不準確。

同源區(qū)設計

設計qPCR引物通常都選擇在同源區(qū)設計，檢測其總RNA情況，具體根據(jù)各自實驗要求而定。

三、設計工具

1. NCBI

登陸 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/，粘貼這段序列，設置好 RANGE 和 PCR 產(chǎn)物的大小，然后在下面點擊 GET PRIMERS，可以在線設計并比對引物。

最后選擇一個比較特異性的引物，條帶大小要盡量單一，其他的基因序列盡量不要比對到。

2.Primer Premier 5軟件

具體教程：https://jingyan.baidu.com/article/72ee561a18d98ae16138df8a.html

如果鏈接失效建議百度，嘿嘿！

3. 生物公司官網(wǎng)免費設計

比如上海生工：https://www.sangon.com

四、設計后比對

以下參考上海生工技術(shù)服務：https://www.sangon.com/class_Primer-Blast.html

主要目的：使用 Primer-Blast 比對引物的特異性

引物的特異性

引物是一段短的單鏈寡核苷酸，在PCR過程的退火階段，引物與單鏈模板結(jié)合，DNA聚合酶沿著引物的3末端向后進行DNA的合成。引物與模板的結(jié)合遵循堿基互補配對的原則，因此，當退火溫度不合適或引物設計不合理時，引物會結(jié)合到模板的非目標區(qū)域，從而導致其他片段的擴增。

所謂引物特異性，就是引物結(jié)合模板正確位置的能力，或者避免結(jié)合非目標位置的能力。引物的長度、GC含量、堿基分布、Tm值等性質(zhì)，均會影響其特異性。

Primer-Blast比對引物特異性的原理

NCBI收錄了諸多物種的基因組DNA、編碼序列mRNA以及其他相關(guān)核酸序列的數(shù)據(jù)。使用Primer-Blast進行比對，首先要輸入一對引物序列，并選擇序列所屬數(shù)據(jù)庫。此時系統(tǒng)將在該數(shù)據(jù)庫中對序列進行查找和對比，并將引物可能結(jié)合的位置進行記錄，一旦結(jié)合位置處于兩條鏈并且產(chǎn)物大小符合要求，系統(tǒng)就會將這種情況列舉到結(jié)果中。需要注意的是，結(jié)合模板的引物不僅是一條正向一條反向，也有可能是兩條正向或者兩條反向引物。

Primer-Blast比對引物特異性的步驟

打開NCBI，進入Blast，網(wǎng)頁如下：

點擊上圖紅框標記的Primer-Blast，進入如下界面，在界面引物序列處，將正反向引物序列粘貼進去，5-3方向。產(chǎn)物大小默認為70~1000，可以根據(jù)實際情況進行調(diào)整。

選擇相應的物種和參考數(shù)據(jù)庫。

首先，要確保Specificity check一欄中已經(jīng)打勾。Search mode一般選擇Automatic即可。

物種：人源的基因選擇Homo sapiens(taxid:9606)；小鼠的選擇Mus musculus (taxid:10090)；大鼠的選擇Rattus norvegicus(taxid:10116)。

參考數(shù)據(jù)庫：要看PCR的模板是什么，如果是提取的RNA反轉(zhuǎn)錄后得到cDNA就選擇Refseq mRNA（針對mRNA）或Refseq RNA（針對mRNA和lncRNA）；若模板是基因組，則應該選擇Refseq representative genomes。在Exclusion行中，可以對預測的序列以及環(huán)境/不可培養(yǎng)樣本序列的干擾。

分析

選好數(shù)據(jù)庫和物種后點擊頁面左下角的Get Primers，系統(tǒng)進行分析，一段時間后會進入如下頁面：（該頁面以一對人EGFR的qPCR引物為例）

結(jié)果分析

上圖顯示了多個結(jié)果，原因是EGFR基因有多個轉(zhuǎn)錄變體，這對引物能夠?qū)⑾路斤@示出來的變體都檢測到。

每個結(jié)果分為多個部分：

第一部分為比對出來的基因結(jié)果；對于mRNA數(shù)據(jù)庫，提供了該mRNA的NM號，對于基因組數(shù)據(jù)庫，則會顯示出基因組編號，點進去會出現(xiàn)預測的產(chǎn)物序列。

第二部分為預測出來的產(chǎn)物大小。

第三部分為正反向引物和模板的結(jié)合形式，“點”代表該位置的序列和模板完全互補配對。

非特異性結(jié)果如下：

如上圖，紅框位置并非是“點”，而是堿基，說明該位置跟模板不匹配，這種屬于潛在的非特異性擴增結(jié)果。

總結(jié)

對于常規(guī)PCR，產(chǎn)物可以通過凝膠電泳對非特異性條帶進行分離，引物的非特異性并不是很重要，但是對于SYBR Green染料法熒光定量PCR，引物的特異性則非常重要。但是，并不是說預測出了非特異結(jié)果，引物的性質(zhì)就一定不好，需要具體情況具體對待：

首先，引物的3端對擴增效率的影響是非常大的，如果預測出的非特異性結(jié)果中，3端存在不匹配堿基，說明即使引物能夠結(jié)合模板，但3端會翹起，導致無法擴增，這一類的非特異結(jié)果可以忽略。

其次，PCR的產(chǎn)物大小是有限制的，尤其對于qPCR，由于延伸時間非常有限，大于1000的產(chǎn)物是基本上無法擴增出來的，如果非特異性產(chǎn)物遠大于目的產(chǎn)物大小，這種非特異性結(jié)果也是可以忽略的。

最后，任何引物工具或者軟件，都是根據(jù)一定的參數(shù)和算法進行的預測，結(jié)果只是起到了參考、建議的作用，并不能代表該引物的實際使用情況。最后引物的好壞需要設計合成后，使用了才能明確。