原則

1、引物長度一般在15-30bp。常用的為18-27bp，但不應(yīng)大于38bp，因?yàn)檫^長會導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于Taq DNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)；

2、引物GC含量一般為40%-60%， 45-55%為宜，GC含量過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。上下游引物GC含量和Tm值要保持接近；

3、引物所對應(yīng)的模板序列的Tm值最好在72℃左右。至少要在55-80℃之間。

4、引物3’端的堿基一般不用A。A在錯誤引發(fā)位點(diǎn)的引發(fā)效率相對比較高。引物3’端出現(xiàn)3個(gè)以上的連續(xù)堿基，如GGG或CCC，或者引物3’端的互補(bǔ)、二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導(dǎo)致PCR反應(yīng)失敗。

5、堿基要隨機(jī)分布，且引物自身和引物之間不能有連續(xù)4個(gè)堿基的互補(bǔ)。

6、 盡量在Exon junction上設(shè)計(jì)引物，限制基因組DNA擴(kuò)增。

7、 使用BLAST檢索，確認(rèn)引物特異性。Max Self Complementarity 缺省值是8.00，Max 3' Self Complementarity 缺省值是3.00

進(jìn)入NCBI ，選擇BLAST

BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫或DNA數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行相似性比較的分析工具。BLAST程序能迅速與公開數(shù)據(jù)庫進(jìn)行相似性序列比較。BLAST結(jié)果中的得分是對一種對相似性的統(tǒng)計(jì)說明。

NCBI的Primer-BLAST頁面，提交的界面主要包括四個(gè)部分：PCR template（模板區(qū)）, Primer Parameters（引物參數(shù)區(qū)）, 和Exon/intron selection（外顯子內(nèi)含子選擇區(qū)），Primer Pair Specificity Checking Parameters（驗(yàn)證引物特異性）

在PCR Template下方文本框中我們也輸入FASTA格式的序列或Accession Number，或點(diǎn)擊“選擇文件”載入FASTA格式的文件。右側(cè)可以設(shè)置正向引物和反向引物的起始和終止位置。在“Primer Parameters”模塊，可以輸入PCR產(chǎn)物的大小（PCR product size）和Tm值參數(shù)。如何你已經(jīng)設(shè)計(jì)好了物，要拿來驗(yàn)證引物的好壞，可以在此輸入。引物Tm溫度接近，設(shè)置差2℃。

NCBI BLAST點(diǎn)custom可以導(dǎo)入自己的DNA文件進(jìn)行比對。

注：

NCBI上是基因負(fù)鏈。

基因正鏈=有義鏈=編碼鏈，基因負(fù)鏈=反義鏈=模板鏈。