臨近新年了，今天29號(hào)，但是沒啥年味呢？？今天我給大家分享一個(gè)單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的內(nèi)容，文章在Single-Cell Transcriptomic Analyses of Tumor Ecosystems and Spatial Architectures in Human Small Cell Lung Cancer。
ABSTRACT
小細(xì)胞肺癌 (SCLC) 是一種高度異質(zhì)性的疾病，其特征是侵襲性表型和預(yù)后不良。為了剖析 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的細(xì)胞成分及其空間分布，對(duì) 12 個(gè)切除的人類原發(fā)性 SCLC 進(jìn)行了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。分析揭示了腫瘤和非腫瘤細(xì)胞的廣泛異質(zhì)性，以及主要的免疫抑制微環(huán)境。重要的是，多種雜合腫瘤細(xì)胞狀態(tài)被揭露，包括雜合 SCLC 和肺腺癌細(xì)胞以及雜合腫瘤和免疫細(xì)胞，表明腫瘤細(xì)胞具有高表型可塑性。此外，揭示了這些雜合腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞起源和進(jìn)化，以及腫瘤-基質(zhì)細(xì)胞串?dāng)_在驅(qū)動(dòng)雜合細(xì)胞發(fā)育中的關(guān)鍵作用。總之，這項(xiàng)研究加深了對(duì)人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)的理解，并為針對(duì) SCLC 治療的雜交腫瘤細(xì)胞和免疫抑制微環(huán)境提供了理論依據(jù)。
INTRODUCTION
小細(xì)胞肺癌 (SCLC) 是一種難治性肺癌，其特征是對(duì)化療的初始反應(yīng)后快速?gòu)?fù)發(fā)。不幸的是，在過去的三十年里，SCLC 患者的治療選擇非常有限。更糟糕的是，缺乏用于生物醫(yī)學(xué)研究的手術(shù)標(biāo)本一直是一個(gè)障礙，許多研究嚴(yán)重依賴臨床前模型，例如基因工程小鼠和患者來源的異種移植 (PDX) 模型。然而，源自這些模型的腫瘤不能完全概括人類 SCLC 的生物學(xué)特征，例如浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞以及腫瘤生態(tài)系統(tǒng)的空間結(jié)構(gòu)。值得注意的是，SCLC 已被揭示為一種高度異質(zhì)性的疾病，在小鼠和人類 SCLC 腫瘤中均表現(xiàn)出廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性，這與侵襲性表型和預(yù)后不良直接相關(guān)。最近，基于轉(zhuǎn)錄因子（ASCL1、NEUROD1、POU2F3 和 YAP1）的差異表達(dá)定義了 SCLC 的四種分子亞型，包括 SCLC-A 和 SCLC-N 神經(jīng)內(nèi)分泌（NE）亞型，以及 SCLC-P 和 SCLC -Y 非 NE 亞型。不同的 SCLC 亞型對(duì)靶向治療具有不同的脆弱性。例如，觀察到 SCLC-A 亞型對(duì) BCL2 抑制劑更敏感，而 SCLC-N 和 SCLC-P 亞型分別對(duì)極光激酶抑制劑和 PARP 抑制劑更敏感。最近，一種炎癥亞型 (SCLC-I) 對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷 (ICB) 表現(xiàn)出更高的敏感性。此外，MHC I 表達(dá)在具有非 NE 特征的 SCLC 細(xì)胞亞群中增加，已被確定為預(yù)測(cè)因子ICB 功效。鑒于 SCLC 腫瘤的異質(zhì)性，迫切需要剖析腫瘤成分并提供更精細(xì)的 SCLC 亞型分類，以開發(fā)下一代精準(zhǔn)療法（有臨床運(yùn)用價(jià)值）。
近年來，單細(xì)胞 RNA 測(cè)序（scRNA-seq）已被廣泛用于研究人類癌癥中的腫瘤異質(zhì)性，包括非小細(xì)胞肺癌、胰腺癌、頭頸部鱗狀細(xì)胞癌和乳腺癌，這提供了前所未有的研究。分辨率以表征腫瘤生態(tài)系統(tǒng)中不同細(xì)胞成分之間的單個(gè)細(xì)胞和細(xì)胞間通訊的分子特征。值得注意的是，scRNA-seq 還被用于使用 PDX、CDX 模型和人體標(biāo)本研究 SCLC 的腫瘤異質(zhì)性。例如，通過對(duì) 21 個(gè)人類 SCLC 標(biāo)本進(jìn)行 scRNA-seq 分析，發(fā)現(xiàn)了具有干細(xì)胞樣特征的高 PLCG2 腫瘤細(xì)胞群。然而，在這些研究中測(cè)序的大多數(shù) SCLC 標(biāo)本都是活檢樣本，每個(gè)樣本測(cè)序的單個(gè)細(xì)胞數(shù)量相對(duì)有限。此外，浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的landscope大多仍未探索。此外，尚未研究人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中不同細(xì)胞成分的空間結(jié)構(gòu)。為了解決這些限制，本研究應(yīng)用結(jié)合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析來剖析人類 SCLC 腫瘤中的細(xì)胞成分及其空間分布。研究結(jié)果揭示了組織和腫瘤內(nèi)廣泛的腫瘤異質(zhì)性。分析還揭示了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中主要的免疫抑制微環(huán)境。重要的是，發(fā)現(xiàn)了多種雜合腫瘤細(xì)胞狀態(tài)，包括雜合腫瘤和免疫細(xì)胞的一個(gè)子集。通過整合 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，描述了不同cluster的分布及其在單個(gè)腫瘤中的相互作用。總之，分析工作提供了 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞成分的單細(xì)胞圖譜和空間分布。
RESULTS
A Single-Cell Transcriptome Atlas of Human Primary SCLC Tumors
為了剖析 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的異質(zhì)細(xì)胞成分及其空間分布，共收集了 12 名接受手術(shù)的 SCLC 患者的 12 個(gè)原發(fā)性腫瘤。首先，對(duì) 7 個(gè) SCLC 進(jìn)行了 scRNA-seq 分析，包括 3 個(gè)化療治療的腫瘤和 4 個(gè)未治療的腫瘤。為了識(shí)別每個(gè)腫瘤中的稀有細(xì)胞亞群，對(duì)每個(gè)腫瘤平均約 13,800 個(gè)單細(xì)胞進(jìn)行了測(cè)序，在所有腫瘤中總共有 81,841 個(gè)高質(zhì)量細(xì)胞。通過無監(jiān)督聚類分析，確定了 27 個(gè)不同的細(xì)胞clusters，包括腫瘤細(xì)胞、白細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞。進(jìn)一步推斷每個(gè)clusters的拷貝數(shù)改變（CNV），以區(qū)分腫瘤和非腫瘤細(xì)胞。因此，基于推斷的CNV和典型細(xì)胞類型標(biāo)志物的表達(dá)，15個(gè)clusters被定義為腫瘤細(xì)胞，而9個(gè)clusters和3個(gè)clusters分別被分類為白細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞。值得注意的是，觀察到大量腫瘤細(xì)胞同時(shí)表達(dá) ASCL1 和 NEUROD1，表現(xiàn)出 SCLC-A 和 SCLC-N 亞型之間混合狀態(tài)的特征。此外，在腫瘤微環(huán)境 (TME) 中鑒定出三種主要類型的基質(zhì)細(xì)胞，包括 FAP+ ACTA2+ 肌成纖維細(xì)胞、MCAM+ ACTA2+ 血管周圍樣細(xì)胞和 PECAM1+ CD34+ 內(nèi)皮細(xì)胞。此外，在 7 個(gè) SCLC 中觀察到廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。值得注意的是，發(fā)現(xiàn) SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的數(shù)量相對(duì)較低。此外，觀察到與未治療的腫瘤相比，化療治療的腫瘤中浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的比例相對(duì)較低，表明化療可能會(huì)重塑 SCLC 微環(huán)境。
Spatial Transcriptomic Landscape of Cellular Components in SCLC Ecosystems
為了探索不同細(xì)胞成分的空間定位及其相互作用，接下來對(duì) 8 個(gè)經(jīng)免疫組織化學(xué)驗(yàn)證的人類 SCLC 腫瘤進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析，包括 6 個(gè) SCLC-A、1 個(gè) SCLC-N 和 2 個(gè) SCLC-P 腫瘤。 值得注意的是，8 個(gè)腫瘤中的 3 個(gè)（LC-250、LC-251 和 LC-51）通過 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)進(jìn)行了測(cè)序。 共捕獲了來自 8 個(gè)腫瘤的 16,853 個(gè)spot，對(duì)其進(jìn)行測(cè)序并分組為 17 個(gè)clusters。 接下來，探索了每個(gè)腫瘤內(nèi)單個(gè)亞群的空間分布。 分析進(jìn)一步揭示了 SCLC 廣泛的腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。 因此，隨后分別分析了單個(gè)腫瘤的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)數(shù)據(jù)。
例如，在 LC-251 中識(shí)別出 8 個(gè)空間spot clusters，包括 5 個(gè)腫瘤細(xì)胞clusters（clusters 1、4、5、7 和 8）和 3 個(gè)基質(zhì)細(xì)胞clusters（clusters 2、3 和 6）。 我們觀察到clusters 1、4 和 5 位于組織中心，而clusters 7 位于 LC-251 組織內(nèi)的組織邊緣。 通過query每個(gè)clsuters的差異基因表達(dá)，發(fā)現(xiàn)clusters 4 顯示 H3F3A、HMGN2 和 TXN 的高表達(dá)，而clusters 7 顯示 SFTPC 和 NAPSA 的高表達(dá)。 重要的是，觀察到clusters 7 表達(dá) SCLC 和肺腺癌 (LUAD) 的標(biāo)志物，顯示出混合轉(zhuǎn)錄狀態(tài)的特征。 此外，發(fā)現(xiàn)clusters 5 表現(xiàn)出高表達(dá)的基質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物，如 COL4A1、SPARC、ESM1 和 RGS5。 同樣，在 LC-51 組織中也發(fā)現(xiàn)了混合 SCLC/LUAD 細(xì)胞.
接下來，檢查了 SCLC 組織內(nèi)基質(zhì)細(xì)胞和免疫細(xì)胞的空間分布。在 LC-251 組織中，觀察到基質(zhì)細(xì)胞（clusters 2 和 3）圍繞并分離不同的腫瘤細(xì)胞clusters。 此外，CD45+免疫細(xì)胞往往在組織內(nèi)分布稀疏，多為耗竭的CD8+ T細(xì)胞和M2巨噬細(xì)胞，表明存在免疫抑制微環(huán)境。 據(jù)我們所知，這是第一個(gè)使用高分辨率轉(zhuǎn)錄組學(xué)探索人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞成分空間結(jié)構(gòu)的分析。 結(jié)果不僅揭示了腫瘤內(nèi)異質(zhì)性的程度，而且還提供了 SCLC 腫瘤內(nèi)不同細(xì)胞類型及其分子特征的空間分布.
Immune Cell Landscape and Spatial Distribution in SCLC Ecosystems
人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中浸潤(rùn)的白細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞的多樣性和轉(zhuǎn)錄組學(xué)特征相對(duì)尚未探索。在這項(xiàng)研究中，通過 scRNA-seq 共鑒定出 14,755 個(gè)浸潤(rùn)性白細(xì)胞。觀察到 7 個(gè) SCLC 中免疫細(xì)胞的高腫瘤間和腫瘤內(nèi)異質(zhì)性。例如，LC-242 和 LC-254 腫瘤的免疫細(xì)胞浸潤(rùn)相對(duì)較高，而 LC-51 和 LC-255 腫瘤浸潤(rùn)較低。進(jìn)一步將所有免疫細(xì)胞重新聚集成 23 個(gè)亞群。根據(jù)典型標(biāo)記的表達(dá)，大多數(shù)亞群可定義為 CD4 T 細(xì)胞、CD8 T 細(xì)胞、NKT 細(xì)胞、漿細(xì)胞和 B 細(xì)胞、類胰蛋白酶 + 肥大細(xì)胞、漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞 (pDC) 和單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞。然而，觀察到 5 個(gè)亞群（clusters 7、11、12、13 和 22）也表達(dá)上皮細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物，例如 EPCAM、INSM1 和 ASCL1，顯示出雜合腫瘤和免疫細(xì)胞的特征。值得注意的是，腫瘤細(xì)胞上免疫細(xì)胞標(biāo)志物的陽性表達(dá)已在幾種癌癥中得到描述.
接下來，對(duì) SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的 T 細(xì)胞亞群進(jìn)行了表征。對(duì)于 CD4+ T 細(xì)胞，cluster 8 代表以高表達(dá) FOXP3 為特征的調(diào)節(jié)性 T 細(xì)胞，cluster 9 代表顯示高水平 CXCL13、NR3C1 和 FKBP5 的濾泡輔助 T 細(xì)胞，而cluster 3 指顯示高水平 IL7R 和 BTG1 的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞.關(guān)于 CD8+ T 細(xì)胞，cluster 6、17 和 19 代表具有高表達(dá) GZMK、CCL5、NKG7 和 GZMA 的細(xì)胞毒性 T 細(xì)胞，而cluster 10 表達(dá)高水平的 GNLY 和 KLRD1，代表 NKT 細(xì)胞。此外，發(fā)現(xiàn)cluster 16 包含 CD4+ 和 CD8+ T 細(xì)胞，并表現(xiàn)出 MKI67 和 ASPM 基因的高表達(dá)，代表增殖 T 細(xì)胞亞群。重要的是，發(fā)現(xiàn)大多數(shù) T 細(xì)胞表現(xiàn)出與免疫檢查點(diǎn)基因相關(guān)的陽性表達(dá)T 細(xì)胞耗竭，如 PDCD1、CTLA4、TIGIT、LAG3 和 HAVCR2，表明免疫抑制微環(huán)境在 SCLC 微環(huán)境中占主導(dǎo)地位。
以前，已觀察到 T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞是 SCLC 中最豐富的浸潤(rùn)免疫細(xì)胞，而通過免疫組織化學(xué)分析評(píng)估 B 細(xì)胞是稀疏的。 在這里，發(fā)現(xiàn)浸潤(rùn)的 B 細(xì)胞的比例與 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中的 T 細(xì)胞和骨髓細(xì)胞相當(dāng)，但大多數(shù) B 細(xì)胞是漿細(xì)胞并且表現(xiàn)出顯著的異質(zhì)性。 發(fā)現(xiàn)漿細(xì)胞的特征是 IGKC、IGHG1 和 MZB1 的高表達(dá)，而 CD20+ B 細(xì)胞的特征是 BANK1 和 CD37 的高表達(dá)。 此外，發(fā)現(xiàn) CD20+ B 細(xì)胞群由活化的 (CD19+ CD20+ CD69+ CD27+) 和耗盡的 (CD19+ CD20+ CD69+ CD27-) 細(xì)胞組成。 通過差異表達(dá)基因的功能注釋，觀察到抗原加工和呈遞是 CD20+ B 細(xì)胞中最豐富的途徑之一。此外，觀察到血漿和 CD20+ B 細(xì)胞在組織內(nèi)分布稀疏 。
此外，確定了 4 個(gè)骨髓細(xì)胞亞群。 cluster 5 代表以 APOE、APOC1 和 SPP1 高表達(dá)為特征的 C1QB+ 巨噬細(xì)胞，而cluster 15 代表 FCN1+ 單核細(xì)胞，顯示 S100A9、LYZ 和 CST3 的高表達(dá)。 此外，觀察到cluster 23 代表高表達(dá) TPSB2 和 TPSAB1 的肥大細(xì)胞亞群，而cluster 21 代表高表達(dá) IRF7 和 GZMB 的 pDC。 此外，觀察到大多數(shù)巨噬細(xì)胞表現(xiàn)出 CD163、LAIR1、HAVCR2、LGALS9、VSIR 和 LAG3 的高表達(dá)，表明免疫抑制性 M2 巨噬細(xì)胞在 SCLC TME 中占優(yōu)勢(shì)。最后，觀察到巨噬細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)并且主要分布在 LC 的基質(zhì)內(nèi) -251 和 LC-29 腫瘤。 總之，分析提供了浸潤(rùn)免疫細(xì)胞的單細(xì)胞圖譜及其在人類 SCLC 微環(huán)境中的空間分布。
Landscape of Stromal Fibroblasts and Endothelial Cells in SCLC Ecosystems
癌癥相關(guān)成纖維細(xì)胞 (CAF) 是 TME 的主要組成部分，已被證明在腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展中起關(guān)鍵作用。然而，關(guān)于 CAF 的類別及其在 SCLC 中的功能作用知之甚少。在這里，通過 scRNA-seq 共鑒定出 3,145 個(gè) CAF，將其分為 15 個(gè)亞群。此外，在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中揭示了 5 個(gè)成纖維細(xì)胞狀態(tài)（這個(gè)地方的方法還是要注意一下）。 S1 CAF 類似于血管周圍樣細(xì)胞，顯示出 MCAM 和 ACTA2 的高表達(dá)，富含粘著斑、cGMP-PKG 信號(hào)傳導(dǎo)和血管平滑肌收縮通路。 S2 CAF 代表以 FAP 和 PDGFRA 高表達(dá)為特征的肌成纖維細(xì)胞，富含 ECM-受體相互作用和粘著斑通路。重要的是，S3、S4 和 S5 成纖維細(xì)胞類似于經(jīng)歷 EMT 程序的腫瘤細(xì)胞，共表達(dá)間充質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞的標(biāo)志物，包括 ACTA2、INSM1、ASCL1 和 GRP。因此，可以將成纖維細(xì)胞分為三種主要亞型，包括 FAP+ 肌成纖維細(xì)胞、MCAM+ 血管周圍樣細(xì)胞和 EPCAM+ 成纖維細(xì)胞。已在多種癌癥中發(fā)現(xiàn)抗原呈遞和炎癥性 CAF。有趣的是，發(fā)現(xiàn)一部分 EPCAM+ CAFs 也表達(dá)免疫細(xì)胞的標(biāo)志物，例如第 3 clusters中 CD24、IGHG2 和 IGLC2 的高表達(dá)，以及第 13 clusters中 IGHG1、IGHG4 和 MZB1 的高表達(dá)。總的來說，研究提供了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中 CAF 的單細(xì)胞圖譜，并強(qiáng)調(diào) EPCAM+ CAF 最有可能來自經(jīng)歷過 EMT program的腫瘤細(xì)胞。
此外，在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中確定了總共 1,308 個(gè)血管內(nèi)皮細(xì)胞 (ECs)，其中包含 10 個(gè)亞群，可分為 3 個(gè)狀態(tài)。 S1 ECs 類似于腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞，共表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞標(biāo)志物，如 PECAM1、ASCL1 和 GRP。 S2 ECs表現(xiàn)出內(nèi)皮細(xì)胞的典型特征，表達(dá)高水平的MCAM、ANGPT2和ESM1，而S3 ECs表現(xiàn)出高表達(dá)VWF、ACKR1、HLA-DRB5和RGS5。 值得注意的是，據(jù)報(bào)道，非神經(jīng)內(nèi)分泌 SCLC 細(xì)胞在轉(zhuǎn)錄上準(zhǔn)備好進(jìn)行血管模擬并表達(dá)假性缺氧的基因表達(dá)譜。 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明，SCLC 細(xì)胞誘導(dǎo)血管生成以支持其快速生長(zhǎng)的機(jī)制之一可能是通過腫瘤-內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)化。 最后，強(qiáng)調(diào)了基質(zhì)細(xì)胞的異質(zhì)性及其在人類 SCLC 組織中的空間定位。
Hybrid Tumor Cells with Multiple Cell Lineage Features Revealed in Human SCLCs
在這項(xiàng)研究中，通過 scRNA-seq 共鑒定出 62,633 個(gè)腫瘤細(xì)胞，占 7 個(gè) SCLC ecosystems中所有細(xì)胞成分的約 77%。進(jìn)一步將這些腫瘤細(xì)胞重新聚集成 26 個(gè)亞群，這些亞群在組織和腫瘤內(nèi)表現(xiàn)出廣泛的異質(zhì)性。觀察到大多數(shù)亞群同時(shí)表達(dá) ASCL1 和 NEUROD1，顯示出混合 SCLC-A/N 亞型的特征。還觀察到一個(gè) YAP1+ 細(xì)胞亞群（cluster 21 ）顯示高表達(dá) LUAD 標(biāo)記，如 NAPSA、SFTPB 和 SCGB3A1。此外，觀察到一些 POU2F3+ 腫瘤細(xì)胞，它們稀疏地分布在多個(gè)clusters中。值得注意的是，除了混合 SCLC-A/N 細(xì)胞外，還鑒定了多種其他混合腫瘤細(xì)胞狀態(tài)，包括混合上皮/間充質(zhì) (E/M) 細(xì)胞、SCLC/LUAD 細(xì)胞和腫瘤/免疫細(xì)胞。例如，我們觀察到clusters 21、16、11、17、25 和 8 中的細(xì)胞顯示混合 E/M 特征，共表達(dá)上皮和間充質(zhì)標(biāo)志物。有趣的是，具有 EMT 特征的細(xì)胞子集也表達(dá)了 LUAD 標(biāo)記，尤其是在 LC-51 樣本中，這表明混合 SCLC/LUAD 細(xì)胞可能會(huì)經(jīng)歷 EMT 程序。此外，發(fā)現(xiàn)一些腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出高表達(dá)的免疫細(xì)胞標(biāo)志物（CD45、CD27 和 HLA-DRA），表現(xiàn)出混合腫瘤/免疫特征。重要的是，通過流式細(xì)胞術(shù)分析證實(shí)了幾種人類 SCLC 細(xì)胞系中存在表達(dá)免疫細(xì)胞標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞。
最近，在具有非神經(jīng)內(nèi)分泌特征且與對(duì)免疫檢查點(diǎn)阻斷劑 (ICB) 的持久反應(yīng)相關(guān)的一部分 SCLC 中觀察到高 MHC I 表達(dá)，這表明 MHC I 可用作 SCLC 患者免疫反應(yīng)的預(yù)測(cè)生物標(biāo)志物。 在這里，觀察到編碼 MHC I 分子（HLA-A、HLA-B 和 HLA-C）的基因在幾乎所有 SCLC 腫瘤細(xì)胞中的陽性表達(dá)。 有趣的是，發(fā)現(xiàn)編碼 MHC II 分子（HLA-DRA 和 HLA-DRB1）的基因的表達(dá)也在 21、16、17、11、8 和 12 clusters中上調(diào)。MHC II 分子通常在professional抗原-呈遞細(xì)胞，例如 DC、單核細(xì)胞和 B 細(xì)胞。 總的來說，這些發(fā)現(xiàn)表明大多數(shù)雜交腫瘤/免疫細(xì)胞也表現(xiàn)出 EMT 和/或雜交 SCLC/LUAD 細(xì)胞特征，并且可能對(duì) ICB 治療更敏感。 同樣，還鑒定了表達(dá)內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物的腫瘤細(xì)胞亞群，例如 PECAM1、CDH5 和 CD34。
最后，空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析表明，混合 SCLC/LUAD 細(xì)胞主要位于 LC-251 組織內(nèi)的腫瘤邊緣，而它們位于 LC-51 組織的中心。 LC-4腫瘤中的雜交SCLC-A/SCLC-P細(xì)胞和LC-29腫瘤中的雜交SCLC-P/SCLC-Y細(xì)胞在組織內(nèi)隨機(jī)分布。 總之，分析揭示了人類 SCLC 中的多個(gè)雜交腫瘤細(xì)胞。
Trajectory Analysis Reveals Cell of Origin of Hybrid SCLC Cells
為了追蹤 SCLC ecosystems中腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化，對(duì)所有腫瘤細(xì)胞進(jìn)行了軌跡分析。確定了 6 個(gè)分支和 9 個(gè)細(xì)胞states。觀察到分支 1 由states 1、2、3 和 4 細(xì)胞組成，而分支 2、3、4、5 和 6 分別由states 9、8、7、5 和 6 細(xì)胞組成。值得注意的是，分支 5 和分支 6 中的細(xì)胞主要來源于 LC-255 腫瘤，表明存在更多分化states。觀察到進(jìn)化軌跡從states 1 細(xì)胞開始。隨著時(shí)間的推移，其他 8 個(gè)states的細(xì)胞沿著軌跡進(jìn)化。在 SCLC 細(xì)胞的進(jìn)化過程中觀察到了 4 個(gè)分支點(diǎn)，它們都可以成功分化成不同的分支。此外，分析了隨偽時(shí)間變化的 SCLC 和 LUAD 的規(guī)范標(biāo)記的表達(dá)。在軌跡開始時(shí)觀察到 ASCL1、NEUROD1 和 INSM1 的最低表達(dá)（states 1），而這些基因的表達(dá)隨著時(shí)間的推移逐步增加。相比之下，發(fā)現(xiàn) LUAD 和間充質(zhì)標(biāo)志物（NAPSA、SFTPC、VIM）的表達(dá)隨著偽時(shí)間逐步降低。一致地，觀察到states 1 細(xì)胞顯示混合 SCLC/LUAD 細(xì)胞的特征，而states 9 細(xì)胞代表混合 SCLC-A/SCLC-N 細(xì)胞，表明 LUAD 和 SCLC 之間存在潛在的細(xì)胞譜系轉(zhuǎn)變。總之，研究結(jié)果表明，一種潛在的雜交腫瘤細(xì)胞起源細(xì)胞，例如雜交 SCLC/LUAD 細(xì)胞，可能源自 LUAD 細(xì)胞譜系。
SCLC-P 亞型約占所有 SCLC 的 15%，被認(rèn)為是一種具有更強(qiáng)侵襲性的非神經(jīng)內(nèi)分泌型。據(jù)報(bào)道，一些 SCLC-P 腫瘤可能起源于肺上皮中的稀有簇狀細(xì)胞，并表達(dá)簇狀細(xì)胞的典型標(biāo)志物，如 POU2F3、ASCL2 和 AVIL。然而，這種亞型的細(xì)胞起源尚未得到很好的定義。在本研究中，鑒定了多種混合 SCLC-P 細(xì)胞，例如 LC-4 腫瘤中的混合 SCLC-A/SCLC-P 細(xì)胞和 LC-29 腫瘤中的混合 SCLC-P/SCLC-Y 細(xì)胞。為了揭示 SCLC-P 亞型的新起源細(xì)胞，研究了這些腫瘤中腫瘤細(xì)胞的進(jìn)化。軌跡分析揭示了 LC-29 腫瘤中的 3 個(gè)分支和 3 個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。軌跡根從state 1 細(xì)胞開始，該細(xì)胞由來自cluster 6 的細(xì)胞組成，其特征是 LUAD 標(biāo)記的高表達(dá)，例如 NAPSA、SFTPC。隨著時(shí)間的推移，腫瘤細(xì)胞分化為 2 個(gè)分支，其中分支 2 富含來自cluster 2 和 7 的細(xì)胞，而分支 3 富含來自cluster 1、2、3、4、5 和 8 的細(xì)胞。值得注意的是，觀察到LUAD標(biāo)志物的表達(dá)減少，而POU2F3、YAP1、ASCL2和MYC的表達(dá)在分支1到分支3的轉(zhuǎn)變過程中增加。此外，發(fā)現(xiàn)LC-29腫瘤表達(dá)相對(duì)較高水平的KRT5、KRT8和NKX2-1基因.總之，這些發(fā)現(xiàn)表明 SCLC-P 亞型可能起源于肺上皮細(xì)胞中的多種細(xì)胞類型，例如角蛋白 + 基底細(xì)胞、肺泡細(xì)胞和 LUAD 細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。根據(jù)這一假設(shè)，最近在轉(zhuǎn)化的 SCLC 的研究中揭示了 SCLC-P 的簇細(xì)胞非依賴性起源。
此外，我們?cè)?LC-4 腫瘤中鑒定了 4 個(gè)分支和 5 個(gè)細(xì)胞狀態(tài)。 基于每個(gè)clusters的組織學(xué)特征和基因表達(dá)特征，我們將cluster 3 定義為相鄰的正常肺細(xì)胞，將cluster 2 和 5 定義為基質(zhì)細(xì)胞，將cluster 1、4、6 和 7 定義為腫瘤細(xì)胞。 因此，觀察到軌跡根起源于狀態(tài) 1 細(xì)胞，其中填充了來自cluster 1 和 7 的腫瘤細(xì)胞，并且以非神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物（包括 ASCL2 和 POU2F3）的高表達(dá)為特征。 隨著時(shí)間的推移，腫瘤細(xì)胞可以分化為states 4 和 5，它們由來自cluster 4 和 6 的細(xì)胞組成，并顯示出神經(jīng)內(nèi)分泌標(biāo)志物的高表達(dá)。 因此，可以看到 LC-4 腫瘤內(nèi)從 SCLC-P 到 SCLC-A 亞型的轉(zhuǎn)變，從cluster 1 開始，到cluster 4 和 6 結(jié)束。這些發(fā)現(xiàn)表明，SCLC-P 細(xì)胞可能分化為 混合 SCLC-A/SCLC-P 細(xì)胞。
Exploration of Cellular Crosstalk in SCLC Ecosystems
最后，為了確定驅(qū)動(dòng)腫瘤異質(zhì)性的分子機(jī)制，特別是雜交腫瘤細(xì)胞的發(fā)展，分析了 7 個(gè) SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中所有 27 個(gè)細(xì)胞成分之間的配體-受體相互作用。 因此，共鑒定了 34,546 對(duì)配體-受體相互作用。 值得注意的是，觀察到腫瘤和免疫細(xì)胞之間的大量相互作用。 骨髓細(xì)胞表現(xiàn)出最大數(shù)量的相互作用對(duì)。 骨髓和腫瘤細(xì)胞之間的大多數(shù)相互作用是由與免疫反應(yīng)和細(xì)胞外基質(zhì)相關(guān)的分子介導(dǎo)的，例如 CD74-MIF/COPA/APP、HLA-DPB1-TNFSF13B/NRG1 和 SPP1-CD44 對(duì)，以及由趨化因子介導(dǎo) 及其受體，例如 CCL3-IDE、CCL2-CCR10 和 CXCL8-ACKR1 對(duì)。 此外，觀察到 T 細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的幾種已知抑制性相互作用，例如 TIGIT-NECTIN2/NECTIN3 和 PDCD1-CD274/PDCD1LG2 對(duì)。據(jù)報(bào)道，CAFs 可以分泌多種趨化因子和生長(zhǎng)因子，從而能夠重塑 TME 并調(diào)節(jié)腫瘤進(jìn)展。 在這里，觀察到 CAF 和腫瘤細(xì)胞之間的廣泛相互作用，其中大部分是由趨化因子和免疫相關(guān)分子介導(dǎo)的，例如 TIMP1-FGFR2 和 HLA-C-FAM3C 對(duì)。 同樣，揭示了內(nèi)皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，包括 CD74-MIF 和 NRP1-VEGFB 對(duì)。
重要的是，確定了雜交腫瘤細(xì)胞和基質(zhì)細(xì)胞之間的多種相互作用。例如，發(fā)現(xiàn)雜交 SCLC/LUAD 細(xì)胞（cluster 7 ）和骨髓細(xì)胞之間的相互作用是由 CD74-MIF/COPA、C5AR1-RPS19 和 SPP1-CD44 對(duì)介導(dǎo)的，而雜交腫瘤/免疫細(xì)胞之間的相互作用（cluster 9 ）和 FAP+CAFs（cluster 14）由趨化因子、Notch 配體及其各自的受體介導(dǎo)，表明基質(zhì)細(xì)胞可能通過增強(qiáng)細(xì)胞間通訊來驅(qū)動(dòng)這些雜交腫瘤細(xì)胞的發(fā)育。最后，還展示了組織內(nèi)不同細(xì)胞類型之間的細(xì)胞間通訊。例如，探索了基質(zhì)細(xì)胞（cluster 2、3 和 6 ）與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用，尤其是 LC-251 腫瘤內(nèi)的混合 SCLC/LUAD 腫瘤細(xì)胞（cluster 7）。觀察到CD74在基質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá)相對(duì)較高，而COPA、APP和MIF的表達(dá)水平在腫瘤細(xì)胞中相對(duì)較高。總之，工作代表了剖析 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞成分之間的細(xì)胞間通訊的第一步，并提供了在 SCLC 進(jìn)展過程中由配體-受體相互作用介導(dǎo)的細(xì)胞串?dāng)_網(wǎng)絡(luò)。
DISCUSSION
了解驅(qū)動(dòng)腫瘤異質(zhì)性和進(jìn)展的細(xì)胞和分子機(jī)制對(duì)于開發(fā)新的治療策略至關(guān)重要。單細(xì)胞 RNA-seq 已被用于分析 SCLC 的腫瘤異質(zhì)性。然而，這些研究并未提供人類原發(fā)性 SCLC 微環(huán)境中所有細(xì)胞成分及其空間結(jié)構(gòu)的綜合單細(xì)胞圖譜。特別是免疫和基質(zhì)細(xì)胞的景觀尚未得到徹底研究。在這里，邁出了第一步，通過使用 scRNA-seq 和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)剖析人類 SCLC 的復(fù)雜生態(tài)系統(tǒng)。 SCLC的特點(diǎn)是免疫細(xì)胞浸潤(rùn)低的免疫性冷腫瘤。因此，研究還揭示了 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中免疫細(xì)胞的低浸潤(rùn)。然而，數(shù)據(jù)揭示了腫瘤和組織內(nèi)浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞的多樣性和異質(zhì)性，以及它們的轉(zhuǎn)錄特征。重要的是，工作表明，由耗盡的 T 細(xì)胞和 M2 巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的免疫抑制微環(huán)境在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中占主導(dǎo)地位。此外，探索了 SCLC 組織內(nèi)不同免疫亞群的空間分布，并表明大多數(shù)免疫細(xì)胞稀疏地定位于 SCLC 組織內(nèi)。
此外，研究揭示了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中基質(zhì)成纖維細(xì)胞的廣泛異質(zhì)性，因?yàn)榇_定了 15 個(gè) CAF 亞群。值得注意的是，鑒定了一部分 EPCAM+ 成纖維細(xì)胞，它們可能是接受了 EMT 程序的腫瘤細(xì)胞。最近，CD105 已被用作定義基質(zhì)成纖維細(xì)胞的標(biāo)志物，CD105 成纖維細(xì)胞能夠促進(jìn)胰腺癌的抗腫瘤免疫。在目前的研究中，發(fā)現(xiàn) MCAM 可以區(qū)分 SCLC 中的成纖維細(xì)胞。 MCAM+ 成纖維細(xì)胞表現(xiàn)出 RGS5、COX4I2 和 FAM162B 的高表達(dá)，而 MCAM-CAF 表現(xiàn)出細(xì)胞外基質(zhì)成分（如 FAP、PDGFRA 和 PDPN）的高表達(dá)。據(jù)報(bào)道，F(xiàn)AP+ CAF 與多種癌癥中的免疫抑制微環(huán)境有關(guān)。此外，CAF 中的 PDPN 表達(dá)與肺腺癌疾病復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)。因此，我們的研究結(jié)果表明，這些 MCAM 成纖維細(xì)胞可能有助于 SCLC 的免疫抑制微環(huán)境。
最近，在對(duì) 38 個(gè) SCLC CDX 模型的分析中發(fā)現(xiàn)了一種新的 ATOH1+ SCLC 亞型。還鑒定了具有干細(xì)胞樣特征的新型 PLCG2+ SCLC 細(xì)胞亞群，并與耗盡的 CD8+ T 細(xì)胞和免疫抑制性骨髓細(xì)胞群相關(guān)。有趣的是，本研究揭示了多個(gè)混合 SCLC 細(xì)胞亞群。腫瘤細(xì)胞的混合或中間狀態(tài)已在癌癥中廣泛報(bào)道，例如混合 E/M 細(xì)胞。此外，雜交內(nèi)皮/間充質(zhì)和雜交腫瘤/內(nèi)皮細(xì)胞也已在癌癥中發(fā)現(xiàn)。最近，通過單細(xì)胞測(cè)序在幾種癌癥中發(fā)現(xiàn)了雜交腫瘤細(xì)胞。 SCLC 的表型可塑性已被認(rèn)為是 SCLC 細(xì)胞變得更具攻擊性的一種機(jī)制。例如，在人類 SCLC 中揭示了 SCLC-A 和 SCLC-N 之間的中間狀態(tài)。此外，通過批量和 scRNA-seq 數(shù)據(jù)的原型分析揭示了 SCLC 亞型之間的連續(xù)塑性細(xì)胞狀態(tài)。此外，在少數(shù)肺部腫瘤中發(fā)現(xiàn)了聯(lián)合 SCLC 和 NSCLC。例如，從 NSCLC 向 SCLC 的轉(zhuǎn)化已成為驅(qū)動(dòng)免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐藥的機(jī)制之一。根據(jù)這些觀察結(jié)果，我們還剖析了 SCLC 細(xì)胞的表型可塑性，例如在異源 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中存在多個(gè)雜交 SCLC 細(xì)胞，指的是具有多種細(xì)胞譜系特征的腫瘤細(xì)胞。
例如，發(fā)現(xiàn)了幾種新型雜交細(xì)胞，包括雜交 SCLC/LUAD 和雜交腫瘤/免疫細(xì)胞。最近，已經(jīng)在鼻咽癌、皮膚鱗狀細(xì)胞癌和頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等多種癌癥中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)免疫特征的腫瘤細(xì)胞。例如，在鼻咽癌中發(fā)現(xiàn)了表達(dá)腫瘤和免疫細(xì)胞雙重標(biāo)志物（EPCAM、MHC-II 和補(bǔ)體基因）的腫瘤細(xì)胞亞群，并觀察到其具有增加的致瘤特性并與不良預(yù)后相關(guān)。此外，據(jù)報(bào)道，腫瘤細(xì)胞與白細(xì)胞的融合有助于腫瘤異質(zhì)性和增加的轉(zhuǎn)移行為。然而，據(jù)我們所知，顯示出免疫特征的 SCLC 細(xì)胞尚未在其生態(tài)系統(tǒng)中被描述。觀察到幾個(gè)腫瘤細(xì)胞亞群共表達(dá)免疫細(xì)胞（CD45 和 CD27）和神經(jīng)內(nèi)分泌細(xì)胞（INSM1 和 ASCL1）的標(biāo)志物。因此，假設(shè)這些混合腫瘤/免疫細(xì)胞更可能是具有免疫細(xì)胞特征的腫瘤細(xì)胞。然而，這些雜交細(xì)胞的生物學(xué)作用需要在未來的研究中確定。
我們的研究提供了幾個(gè)新發(fā)現(xiàn)。首先，這是人類初級(jí) SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞成分及其空間分布的第一個(gè)單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組景觀。其次，本研究提供了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中不同浸潤(rùn)性免疫細(xì)胞、基質(zhì)成纖維細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的全面視圖和分子特征。第三，我們確定了 SCLC 細(xì)胞的多種雜交狀態(tài)，從雜交 SCLC 亞型、雜交 SCLC/LUAD 到雜交腫瘤/免疫細(xì)胞，表明 SCLC 細(xì)胞的動(dòng)態(tài)進(jìn)化發(fā)生在 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中。第四，還揭示了這些雜合 SCLC 細(xì)胞的進(jìn)化以及 SCLC-P 亞型的新潛在細(xì)胞來源。最后，這項(xiàng)研究全面了解了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞成分內(nèi)部和細(xì)胞之間的細(xì)胞間通訊，為針對(duì)這些相互作用進(jìn)行 SCLC 治療提供了理論依據(jù)。鑒于 SCLC 的異質(zhì)性，未來的研究將需要整合更多的 SCLC 樣本并結(jié)合更高分辨率的空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)。確定我們已經(jīng)確定的腫瘤細(xì)胞狀態(tài)的各種混合狀態(tài)的功能作用和臨床相關(guān)性也至關(guān)重要。總之，本研究提供了人類 SCLC 生態(tài)系統(tǒng)中細(xì)胞成分及其空間分布的綜合單細(xì)胞圖譜，揭示了組織和腫瘤內(nèi)腫瘤、免疫和基質(zhì)細(xì)胞的廣泛異質(zhì)性，并深入了解了它們的轉(zhuǎn)錄狀態(tài)。研究還揭示了人類 SCLC 中的多種雜交腫瘤細(xì)胞狀態(tài)，表明靶向這些雜交腫瘤細(xì)胞可以為 SCLC 患者的下一代治療策略奠定基礎(chǔ)。
Methods（關(guān)注一些重點(diǎn)方法）
Cell-cell interaction analysis
Copy-number variation analysis
生活很好，有你更好
