hello，大家好，今天我們繼續分享單細胞空間聯合分析的文章，大家如果看我的文章也應該發現了，空間轉錄組越來越多的用來解釋關鍵細胞類型的生態位，非常重要，關于生態位的問題，我之前分享了一篇，文章在10X單細胞轉錄組、單細胞核轉錄組、VDJ、空間轉錄組聯合分析識別人肺組織的免疫細胞生態位，解析的是空間層面肺組織免疫細胞的生態位，而今天我們要利用單細胞空間技術，解析肝臟組織的巨噬細胞的生態位，參考的文章在Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily-conserved hepatic macrophage niches ，非常棒的文章，我們今天就來分享。

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研究需要注意的熱點

• 目標細胞的生態位
• 生態位保守的通訊信號
• 單細胞轉錄組和單核轉錄組對細胞類型的捕獲存在差異
• 細胞區域通訊（生態位信號交流，也就是臨近通訊）

Abstract

肝臟是身體中最大的實體器官，但它的特征仍然不完整。 在這里，研究展示了健康人和鼠肝臟的空間蛋白質基因組圖譜，結合了單細胞 CITE-seq、單核測序、空間轉錄組學和空間蛋白質組學。 通過整合這些多組學數據集，提供了經過驗證的策略來可靠地區分和定位所有肝細胞。 然后在七個物種中align這個圖譜，揭示真正的 Kupffer cells and bile-duct macrophages的保守程序。 **還揭示了這些巨噬細胞各自的空間分辨細胞生態位和驅動它們獨特轉錄組學特性的microenvironmental circuits。 分析證明膽管巨噬細胞是由局部脂質暴露誘導的，而Kupffer細胞主要依賴于它們通過進化保守的 ALK1-BMP9/10 軸與肝星狀細胞的crosstalk 。

Introduction

單細胞轉錄組學的巨大技術進步使人們能夠更好地了解跨物種不同器官的細胞組成。然而，仍然缺乏關于這些細胞如何在其獨特的微環境生態位中組織的信息。此外，確定組織內單個細胞身份的特定細胞-細胞相互作用仍有待研究。雖然肝臟內肝細胞的空間組織已被了解，但非實質肝細胞的空間組織仍不清楚，這是小鼠肝臟的情況，但對于人類肝臟更是如此，其中大多數肝細胞的身份和精確定位是未知的。此外，轉錄組和蛋白質組之間的聯系尚未得到研究，導致缺乏可靠的表面標記來通過流式細胞術和共聚焦顯微鏡識別、純化或定位這些細胞。在這里，使用了包括 CITE-seq 和空間方法在內的蛋白質基因組學技術來識別小鼠和人類健康肝臟內的所有細胞及其特定位置。通過這樣做，制定了識別和進一步研究不同細胞類型的策略。為了證明這種方法的有效性，利用這些信息，還確定了在健康肝臟中驅動不同肝巨噬細胞表型的保守空間相關信號。

Results

A practical proteogenomic atlas of the murine liver

為了生成肝臟的蛋白質基因組圖譜，首先檢查了檢索所有肝細胞的最佳方法。 使用鼠肝臟，使用通過離體或體內酶消化分離的細胞與單核 RNA 測序 (snRNA-seq) 比較了單細胞 RNA 測序 (scRNA-seq)。 使用每種技術，我們都觀察到了不同的細胞組成（看來單細胞轉錄組和單核轉錄組表征細胞豐度上還是有差異）。

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• 注： UMAPs showing annotations of cell-types and proportions of each cell type as a % of total cells in the UMAP isolated using (A) ex vivo digestion; 13144 cells, (B) in vivo digestion; 19428 cells and (C) nuclei; 8583 nuclei. (D) Average number of genes/cell in the annotated macrophage population following each isolation method.

雖然 snRNA-seq 產生的基因/細胞數量少于 scRNA-seq，但它最好地概括了體內觀察到的細胞頻率

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• 注： (E-J) Confocal microscopy images to determine true abundance of (E) fibroblasts and cholangiocytes (F) endothelial cells, (G) macrophages, (H) dendritic cells, (I) B cells and (J) T cells in vivo. Scale bar 200μm. (K) The percentage of each population was calculated based on the percentage of a given population divided by the total number of nuclei. A threshold was applied to the DAPI channel (picture 1) in ImageJ (picture 2) and nuclei were automatically counted based on the ImageJ ‘analyze particles’ plugin (size (micron^2 = 10-1000; circularity = 0-1; picture 3). Due to the density of some liver zones, some nuclei were not automatically counted (arrow, picture 3)。Those were then manually counted and added to the total number of nuclei. For the populations of interest, cells were counted manually based on specific markers (for example, CD3 for T cells, picture 4). Counting was performed blinded prior to analysis of the sequencing results. (L) Proportion of indicated cell types as a % of total cells identified in confocal microscopy images. Data are from 3-7 images per cell type taken from 2-4 mice.

鑒于每種方法的不同細胞組成，為確保所有細胞都可以進行分析，選擇在我們的研究中使用所有protocol的組合。 為了在單細胞分辨率下研究 mRNA 和蛋白質表達，通過測序 (CITE-seq) 使用轉錄組和表觀的細胞indexing。 因此，用 107-161 寡偶聯抗體對選定的 scRNA-seq 樣本進行染色。將數據匯集在一起進行單一分析，其中使用 TotalVI 將蛋白質和 mRNA 譜都考慮用于聚類。

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• 注：(A) Hepatic cells were isolated from healthy C57B/l6 mice by ex vivo (5 mice, 15 samples) or in vivo (5 mice, 19 samples) enzymatic digestion. Alternatively, livers were snap frozen and nuclei isolated by tissue homogenization (4 mice, 12 samples). Live cells/intact nuclei were purified using FACS. For cells, total live, live CD45+, live CD45-, live hepatocytes or myeloid cells (live CD45+,CD3-, CD19-, B220-, NK1.1-) were sorted. 18 cell preparations (7 ex vivo, 11 in vivo) were also stained with a panel of 107-161 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 185894 cells/nuclei were clustered using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data

對差異表達的基因和蛋白質的分析確定了 17 種細胞類型。 此外，確定了所有細胞的表面標志物，包括Kupffer細胞 (KCs) 的 VSIG4 和 FOLR2。

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• 注：(A,B) Top DEGs (A) and DEPs (B) for cell types identified in Fig. 1B. (C) Distinct profiles of cells or nuclei within the UMAP depending on isolation protocols; 71162 cells from ex vivo digestions, 96066 cells from in vivo digestions and 18666 nuclei. (D) Expression of VSIG4, CD206 and ESAM (protein, top) and Vsig4, Mrc1 and Esam (mRNA, bottom).

Distinct spatial orientation of hepatic myeloid cell subsets

為了定位鑒定出的細胞，使用 Visium 進行了空間轉錄組學分析。 為此，以兩個不同的方向切割肝臟，以描繪肝臟組織和被膜

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• 注： Tissue and capsule images from Visium analysis with clusters overlaid.

沿著空間軌跡對每個 Visium 點進行排序，并根據已知的肝細胞分區標記對入口、門靜脈周圍、中部和中央區域進行注釋

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• 注：(D) UMAP of zonation of Visium spots (left) & origin of the cells (right). (E) Zonation pattern
  mapped onto tissue slice

通過使用參考 sc/snRNA-seq 數據，我們將每個點解卷積為其組成細胞類型，并研究細胞豐度如何隨分區變化

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• 注： Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data

據報道，驗證這種方法時，膽管細胞專門映射到門脈區，而 KCs 位于門脈周圍和中間區。 此外，我們在所有區域都發現了 T 細胞、內皮細胞 (EC) 和基質細胞 (SC)，而在門靜脈中發現了常規樹突狀細胞 (cDC)，在中央靜脈中發現了少量存在。

為了以單細胞分辨率驗證這些位置，接下來試圖確定也可以通過共聚焦顯微鏡工作的最佳細胞特異性表面標記。 由于用于共聚焦顯微鏡的固定步驟通常會影響不同表位的完整性，因此無法預測哪些在單細胞懸液上起作用的抗體將在固定和完整組織上起作用。 因此，為了同時篩選多種抗體以識別通過顯微鏡起作用的抗體，進行了第二次 Visium 分析，并補充了 100 種寡偶聯抗體（Visium 高度多重蛋白），這些抗體是根據 CITE-seq 結果選擇的。

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• 注： mRNA zonation pattern in Visium Highly-Multiplexed Protein analysis and VSIG4-ADT expression pattern (left) and zonated expression patterns of indicated antibodies (right).

然后，使用 MACSimaTM 成像循環染色 (MICS) 技術和 60 重抗體panel，以單細胞分辨率驗證在空間上起作用的抗體

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• 注：MICS analysis of indicated proteins and cell types. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types

Unfortunately，無法為所有populations識別出有用的表面標記，例如，沒有識別出足夠的區分性表面標記，這些標記可以通過共聚焦顯微鏡在空間上區分 cDC 亞群。 因此，為了確認這些細胞亞群的位置，求助于允許 100 重空間 mRNA 分析的 Molecular Cartography^TM (Resolve BioSciences)。 基于來自 sc/snRNA-seq 數據的 DEG 選擇基因，這些數據也根據 Visium 進行了空間解析。 還使用膽管細胞基因（Epcam、Spp1）和已知的分區肝細胞基因（Glul、Cyp2e1、Hal、Sds）確定了該數據集中的portal-central軌跡

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• 注： (F) Top unbiased genes defining zonation trajectory from portal to central vein in Visium.(H) Molecular Cartography showing expression of indicated zonated hepatocyte mRNAs in liver tissue. Data are representative of 2 mice.

使用 Xcr1、Clec9a (cDC1s) 和 Cd209a、Mgl2 和 Clec10a (cDC2s) 的表達，我們證實 cDC1s 和 cDC2s 主要位于門靜脈

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• 注：Molecular Cartography of indicated genes and cell types

由于 cDC2s 與單核細胞衍生的細胞共享許多基因，還檢查了一般單核細胞/巨噬細胞（Cd14、Adgre1、Axl、Mafb、Cx3cr1、C5ar1）和 KC 特異性基因（Cd5l、Vsig4）的表達，to further validate their identification as bona fide cDC2s.。 該分析進一步表明，鑒定的 cDC2s 是真正的 cDC2s，缺乏任何巨噬細胞/單核細胞標志物，然而，它還鑒定了不同于 KCs 和 cDC2s 的門靜脈和中央靜脈巨噬細胞群。這些分析中 mRNA 表達的punctate nature與髓樣細胞的樹突形狀相結合，使得很難令人信服地確定細胞邊界并得出結論，這些 cDC2 和巨噬細胞是不同的細胞。 為了驗證這一點，開發了一種將 mRNA 檢測 (RNAScope) 與表面蛋白檢測相結合的protocol。 結合蛋白質表面標記檢查 cDC 或巨噬細胞特異性 mRNA 的表達證實了門靜脈 cDC1、cDC2 和非 KC 巨噬細胞的存在

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• 注： mRNA (Xcr1, Flt3l, Mafb and Clec10a) and protein (MHCII and F4/80) expression in the same tissue slice. Scale bar 50μm. PV; portal vein, CV; central vein. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

總之，通過結合多種空間轉錄組學和蛋白質組學方法，定位了小鼠肝臟內的所有細胞，并確定了骨髓細胞內的額外異質性，在單獨檢查 sc/sn-RNA-seq 數據集時沒有發現。 這突出了結合單細胞和空間蛋白質組學技術來研究細胞異質性的力量。

Refined analysis of myeloid cells identifies three subsets of hepatic macrophages

為了更好地理解這些非 KC 巨噬細胞，我們在定義 11 個群體的 sc/snRNA-seq 分析中zoomed in骨髓細胞（cDC、KC、單核細胞和單核細胞衍生細胞）

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這包括 KC、3 組非 KC 巨噬細胞和細胞，其特征介于單核細胞和 patrolling monocytes 或巨噬細胞之間，稱為過渡單核細胞。 對非 KC 巨噬細胞的仔細檢查發現 cluster6 是腹膜巨噬細胞。 其余clusters之間的 DEG 表明 cluster7 可能類似于膠囊巨噬細胞，表達 Cd207 和 Cx3cr1，而 cluster8 類似于我們最近在脂肪肝中描述的 Gpnmb+Spp1+ 脂質相關巨噬細胞 (LAMs)。Conversion of the CITE-seq data into a flow cytometry file allowed an gating strategy to be defined.驗證這一點，利用該策略來純化cluster并評估基因表達。 在消化前清洗肝臟可以使清洗部分中的腹膜巨噬細胞富集，這表明這些是肝臟表面的污染物，而不是存在于肝臟組織本身中。 雖然 CITE-seq 標記不能區分cluster 7 和 8，但在panel中添加 CD207 使非 KC 能夠分為 CD207+ 和 CD207- 巨噬細胞。 與它們被稱為膠囊巨噬細胞的名稱相吻合，如果解剖和消化膠囊，CD207+ 巨噬細胞的相對豐度就會增加。 然而，盡管分子圖譜證實了膠囊中存在 Cd207+ 巨噬細胞，但它也揭示了中央靜脈的 Cd207+ 巨噬細胞，而門靜脈很少發現這種巨噬細胞.

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• 注： (E) Expression of VSIG4 and F4/80 (left) or MHCII, CD11c and DAPI (right) by confocal microscopy. Capsule macrophages (left) or MHCII+ capsule macrophages (right) identified by white arrows. Scale bar 50μm. (F) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at liver capsule. (G) Expression of VSIG4, F4/80, GLUL and DAPI (left) or F4/80 or CCR2 (right, inset) by confocal microscopy. Scale bar 100μm. (H) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at portal triad. PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

因此，cluster7 由囊和中央靜脈 CD207+ 巨噬細胞組成。 這一發現進一步證明需要空間方法來確認細胞身份，因為這種特征以前被認為是膠囊巨噬細胞群所獨有的。 分子圖譜還在門靜脈和中央靜脈處鑒定出巨噬細胞，表達 Ccr2 和 Chil3，類似于過渡單核細胞（cluster11）。 最后，發現一群表達 Gpnmb 的巨噬細胞專門位于膽管周圍。 由于 Gpnmb 表達是 cluster8 特異性的，并且這些細胞類似于 LAM，我們將這些細胞稱為膽管 LAM。

Macrophage subsets reside in distinct spatial niches

由于所有巨噬細胞群都與其局部環境中的 CD45- 細胞密切接觸，進一步分析了 CD45- 細胞，確定了 EC 和 SC 的多個亞群以及區分它們的gating strategy。EC 可以進一步細分為 4 個不同的cluster，對其位置的分析使它們能夠被識別為中央靜脈 EC（cluster 10）、LSEC（cluster 9）、門靜脈 EC（cluster 11）和淋巴 EC（LEC；cluster 12）。由于 Visium 在門靜脈和中央靜脈中都發現了成纖維細胞，并且正如之前的一份報告表明這些細胞中存在不同的亞群，我們進一步分析 SCs 以更好地評估它們的異質性。 這揭示了僅限于膠囊的間皮細胞和成纖維細胞的亞群。 Myh11+ 血管平滑肌細胞 (VSMCs) 位于肝動脈、門靜脈和中央靜脈周圍，發現 Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纖維細胞是中央靜脈成纖維細胞。 最后，確定了位于膽管細胞周圍的 Clic5+Reln+ 成纖維細胞 (cluster3) 的一個subset，將其稱為膽管成纖維細胞。 總之，這些空間上不同的 ECs 和 SCs 子集的存在突出了不同巨噬細胞種群所在的特定微環境的獨特性。

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• 注：Hepatic macrophage populations reside in distinct niches。(A) UMAP of murine CD45- cells (83410 cells/nuclei) isolated from Fig. 1B and re-clustered with TotalVI. (B,C) Top DEGs (B) and DEPs (C) between cell types identified. (D) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data. (E) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at central vein (left) and 2 different portal triads (center and right). (F) UMAP of murine stromal cells (5430 cells/nuclei) isolated from the UMAP in Fig. 3A and reclustered with scVI. (G) Top DEGs between different cell types identified. (H) Identification of Mesothelial cell (top) and VSMC (bottom) signatures on zonated Visium data. (I) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the liver capsule. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the central vein (left) and portal triad (right). PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

A practical proteogenomic atlas of the healthy human liver

為了確定巨噬細胞亞群之間的保守程度及其在小鼠和人類肝臟之間的不同微環境生態位，我們接下來使用 sc/snRNA-seq 和 CITE-seq 對 19 次肝臟活檢生成了人類肝臟的蛋白質基因組圖譜。其中，大多數在組織學上是健康的，只有 5 名患者表現出>10% 的肝脂肪變性。細胞比例因所使用的隔離技術而異，雖然患者之間存在一些差異，但這與手術無關。由于 Visium 可靠地定位了鼠肝細胞，我們使用它來定位 4 次活組織檢查中的人類肝臟細胞。由于>10% 脂肪變性的患者與健康樣本（<10% 脂肪變性）分開聚集，使用健康樣本來計算基線分區，然后將此軌跡轉移到脂肪變性樣本上。這確定了這些患者的脂肪變性主要位于中心周圍。這與之前的臨床研究相吻合，即中央周圍脂肪變性在 NAFLD 患者中最常見，尤其是在門靜脈周圍區域通常不受累的早期疾病中。值得注意的是，盡管中性粒細胞優先位于脂肪變性區，但整體細胞分布不受中央周圍脂肪變性的影響

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• 注：Identification of bona fide Kupffer cells across species 。(A) Cells or nuclei were isolated from liver biopsies (~1-2mm3; 14 cells, 5 nuclei) from patients undergoing either liver resection, cholecystectomy or gastric bypass. Live cells/intact nuclei were purified using FACS. Either total live, live CD45+, live CD45- or lineagecells (live CD45+,CD3-,CD19-) were sorted. 7 cell samples were stained with a panel of 198 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 167598 cells/nuclei were analyzed using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data. (C) UMAP of Visium data from 4 patient biopsy samples. (D) Split of Visium spots based on %steatosis. (E) Healthy and steatotic Visium liver tissue with clusters overlaid and H+E staining to identify steatotic zones. (F) Zonation of Visium data (top) with zonation pattern mapped onto liver tissue (bottom). (G) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto Visium zonation trajectory, healthy (top), steatotic (bottom).、

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An evolutionarily-conserved program of KCs

迄今為止，還沒有描述真正的人類 KCs 的經過驗證的標記。在解釋準確定義人類 KCs 的困難時，發現單核細胞和巨噬細胞在人類 sc/snRNA-seq 數據中形成了一個單一的連續體，阻止了人類 KCs 的簡單定義。為了進一步研究潛在的人類肝臟巨噬細胞異質性，我們分析了骨髓細胞，確定了 10 個cluster。為了定義 KC，接下來檢查了這些cluster對前 25 個鼠類 KC 基因的表達，這些cluster確定了 cluster10 是真正的人類 KC。與小鼠不同，它們優先位于中間區域。 Cluster9 也表達了許多這些基因，但缺乏 TIMD4，這表明這些細胞可能是最近招募的單核細胞衍生的 KCs (moKCs)。盡管單獨的 VSIG4 表達不能準確識別人類肝臟中的 KC，但發現 VSIG4 蛋白是 CITE-seq 數據中人類 KC 的最佳標記物，突出了檢查表面蛋白質組和轉錄組的重要性。這通過流式細胞術和對人肝臟的 VSIG4 和 KC 特異性基因 CD5L 的共染色進行了驗證，這也證實了它們的中帶定位。為了評估 KC 身份在進化中是否進一步保守，對獼猴、豬、倉鼠、雞和斑馬魚的肝臟進行了分析。我們通過將保守的人-鼠 KC 簽名映射到數據集上，以無偏見的方式識別了 KC。然后檢查了確定的每個 KC 群體的主要特征。觀察到跨物種轉錄組的強烈重疊可能是由于核心 KC 轉錄因子的保守表達。 VSIG4 蛋白表達在豬和獼猴 KCs 中也是保守的。同樣，還能夠根據保守基因識別跨物種的大多數其他肝細胞。 cDC2s 是主要的例外，因為特定的 cDC2 標記基因并非在所有物種中都是保守的。

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LAM location is altered in the steatotic human liver

除了 KCs，還在肝囊中發現了人類 CD68+VSIG4-巨噬細胞，靠近中央靜脈和門靜脈以及膽管。在健康獼猴肝臟的門靜脈和中央靜脈以及膽管中也觀察到了類似的populations 。檢查 scRNA-seq 數據并與小鼠特征進行比較，確定了未成熟和成熟的 LAM，從而能夠定義保守的 LAM 特征。盡管最近的一項研究表明這些細胞對纖維化肝臟具有特異性，但在所有使用 scRNA-seq 分析的患者中都發現了 LAM，但在 2 個脂肪變性 >10% 的肝臟中，LAM 的比例有增加的趨勢。與顯微鏡和鼠膽管 LAM 一致，人類 LAM 位于非脂肪肝的匯管區。然而，在脂肪變性的人類肝臟中，LAM 主要位于中央周圍，與脂肪變性相關。在喂食western diet (WD) 36 周以誘發脂肪肝疾病后，在小鼠中使用 Visium 也驗證了 LAM 位置的這種變化。在這里，與整個肝臟存在脂肪變性相吻合，在門靜脈、門靜脈周圍和中間區域發現了 LAM。鑒于兩個物種中 LAMs 的位置與過量脂質的存在以及發現 LAMs 的不同位置之間的生態位細胞的異質性相關，這表明 LAM 表型和豐度可能受脂質暴露而不是特定的在兩個位置保守的局部細胞 - 細胞相互作用。

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Differential NicheNet analysis across species reveals a crucial role for the ALK1-BMP9/10 axis in KCs.

為了評估保守的細胞 - 細胞相互作用與局部代謝物（如脂質）在推動跨物種巨噬細胞異質性方面的作用，我們在不同的肝巨噬細胞和存在于各自nichs中的 CD45-細胞之間進行了差異 NicheNet 分析，重點是配體和在人和小鼠中都保守的受體。與 KCs 相比，這揭示了 LAMs 的特定配體 - 受體對很少，進一步暗示驅動 LAM 表型的主要信號可能不是來自獨特的細胞 - 細胞相互作用。與此一致，用乙酰化低密度脂蛋白培養的 BM 單核細胞表達 LAM 相關基因，表明脂質在誘導 LAM 表型中起主導作用。對形成 KC 生態位藍圖的細胞串擾的進一步研究發現，人和小鼠之間存在多個保守的配體-受體對。其中一個，KCs（ALK1；由 Acvrl1 編碼）和星狀細胞（分別由 Gdf2/Bmp10 編碼的 BMP9/10）之間的 ALK1-BMP9/10 回路被發現在所有 7 個物種中都是保守的，并被預測控制表達許多保守的 KC 轉錄因子。為了驗證這個軸，我們生成了 Fcgr1-Cre x Acvrl1fl/fl 小鼠，從巨噬細胞中消除了 ALK1。這導致 VSIG4+ KCs 幾乎完全喪失，表明進化上保守的 ALK1-BMP9/10 軸對于肝臟中 KC 的存在至關重要。

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Discussion

為了生成任何人體組織的實用細胞圖譜并解開對居住在該組織中的細胞的身份至關重要的細胞-細胞回路，需要四個關鍵信息：（i）存在的所有細胞的清單，（ii）位置 組織內不同細胞之間的相互作用，以識別相鄰細胞之間的相互作用，(iii) 人類和動物模型之間的alignment，允許任何預測的細胞 - 細胞相互作用受到干擾，以及 (iv) 識別可靠的基于抗體的panel有效篩選不同患者和/或轉基因動物。 在這里，通過整合單細胞和空間轉錄組學和蛋白質組學數據，為肝臟提供了這 4 條信息，并揭示了控制肝臟巨噬細胞發育的進化上保守的microenvironmental circuits。
強調需要結合不同的分離策略來正確分析所有肝細胞，證明如果沒有 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的組合，肝臟圖譜中將缺乏不同的人和鼠基質細胞亞群。解開所有肝細胞的空間定位，確定了健康小鼠、人類和獼猴肝臟膽管周圍的 LAM。然而，當存在脂肪變性時，LAMs 會擴張并定位到脂肪變性的周圍區域，這讓人想起 LAMs 在肥胖小鼠肝臟中的擴張。這種空間信息至少部分否定了 LAM 身份是由纖維化基質細胞特異性誘導的假設，并支持 LAM 主要由局部脂質暴露誘導的概念，正如在實驗中所證明的那樣。盡管脂質的確切來源仍有待確定。還提供了七個物種的肝臟圖譜的對齊方式。這揭示了穩態 KCs 的保守轉錄組程序，并揭示了 KCs 與構成其生態位的細胞之間的空間限制和保守的配體-受體對。強調在試圖了解疾病如何擾亂細胞之前首先表征健康組織的必要性，我們將 DLL-NOTCH 相互作用確定為穩態 LSEC 和 KC 之間進化保守的串擾，因此并非肝細胞癌或纖維化所獨有，正如最近提出的那樣。同樣，發現 FOLR2 表達不是腫瘤相關肝巨噬細胞所特有的，而是在健康小鼠和人類肝臟的 KCs 上表達（mRNA 和蛋白質）。最后，應用蛋白質基因組學管道，從廣泛的寡偶聯抗體面板開始，用于單細胞和空間分析。這是至關重要的，因為轉錄組分析并不總是與通過流式細胞術或顯微鏡檢測蛋白質的能力相對應。通過廣泛篩選，確定了分離和定位肝巨噬細胞及其各自生態位細胞的最佳表面標志物。這既可以驗證單細胞水平的空間位置，也可以有效篩選轉基因小鼠模型的 KCs 損失。使用定義的panel對 Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl 小鼠的表征很容易證明 ALK1-BMP9/10 軸在 KCs 中的重要性，強調巨噬細胞-成纖維細胞的串擾比生長因子的交換更進一步。展望未來，將這些相對便宜的抗體組應用于大型患者隊列或多個轉基因小鼠模型應該能夠有效識別任何擾亂肝臟穩態的擾動。

Methods(關注一些關鍵的方法)

Probabilistic graphical modelling （Modelling of Visium data ）

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Reference for deconvolution

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Deconvolution

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Differential abundance along zonation

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生活很好，有你更好