hello，大家好，今天我們繼續(xù)分享單細(xì)胞空間聯(lián)合分析的文章，大家如果看我的文章也應(yīng)該發(fā)現(xiàn)了，空間轉(zhuǎn)錄組越來越多的用來解釋關(guān)鍵細(xì)胞類型的生態(tài)位，非常重要，關(guān)于生態(tài)位的問題，我之前分享了一篇，文章在10X單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組、單細(xì)胞核轉(zhuǎn)錄組、VDJ、空間轉(zhuǎn)錄組聯(lián)合分析識(shí)別人肺組織的免疫細(xì)胞生態(tài)位，解析的是空間層面肺組織免疫細(xì)胞的生態(tài)位，而今天我們要利用單細(xì)胞空間技術(shù)，解析肝臟組織的巨噬細(xì)胞的生態(tài)位，參考的文章在Spatial proteogenomics reveals distinct and evolutionarily-conserved hepatic macrophage niches ，非常棒的文章，我們今天就來分享。

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研究需要注意的熱點(diǎn)

• 目標(biāo)細(xì)胞的生態(tài)位
• 生態(tài)位保守的通訊信號(hào)
• 單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單核轉(zhuǎn)錄組對(duì)細(xì)胞類型的捕獲存在差異
• 細(xì)胞區(qū)域通訊（生態(tài)位信號(hào)交流，也就是臨近通訊）

Abstract

肝臟是身體中最大的實(shí)體器官，但它的特征仍然不完整。 在這里，研究展示了健康人和鼠肝臟的空間蛋白質(zhì)基因組圖譜，結(jié)合了單細(xì)胞 CITE-seq、單核測(cè)序、空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和空間蛋白質(zhì)組學(xué)。 通過整合這些多組學(xué)數(shù)據(jù)集，提供了經(jīng)過驗(yàn)證的策略來可靠地區(qū)分和定位所有肝細(xì)胞。 然后在七個(gè)物種中align這個(gè)圖譜，揭示真正的 Kupffer cells and bile-duct macrophages的保守程序。 **還揭示了這些巨噬細(xì)胞各自的空間分辨細(xì)胞生態(tài)位和驅(qū)動(dòng)它們獨(dú)特轉(zhuǎn)錄組學(xué)特性的microenvironmental circuits。 分析證明膽管巨噬細(xì)胞是由局部脂質(zhì)暴露誘導(dǎo)的，而Kupffer細(xì)胞主要依賴于它們通過進(jìn)化保守的 ALK1-BMP9/10 軸與肝星狀細(xì)胞的crosstalk 。

Introduction

單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)的巨大技術(shù)進(jìn)步使人們能夠更好地了解跨物種不同器官的細(xì)胞組成。然而，仍然缺乏關(guān)于這些細(xì)胞如何在其獨(dú)特的微環(huán)境生態(tài)位中組織的信息。此外，確定組織內(nèi)單個(gè)細(xì)胞身份的特定細(xì)胞-細(xì)胞相互作用仍有待研究。雖然肝臟內(nèi)肝細(xì)胞的空間組織已被了解，但非實(shí)質(zhì)肝細(xì)胞的空間組織仍不清楚，這是小鼠肝臟的情況，但對(duì)于人類肝臟更是如此，其中大多數(shù)肝細(xì)胞的身份和精確定位是未知的。此外，轉(zhuǎn)錄組和蛋白質(zhì)組之間的聯(lián)系尚未得到研究，導(dǎo)致缺乏可靠的表面標(biāo)記來通過流式細(xì)胞術(shù)和共聚焦顯微鏡識(shí)別、純化或定位這些細(xì)胞。在這里，使用了包括 CITE-seq 和空間方法在內(nèi)的蛋白質(zhì)基因組學(xué)技術(shù)來識(shí)別小鼠和人類健康肝臟內(nèi)的所有細(xì)胞及其特定位置。通過這樣做，制定了識(shí)別和進(jìn)一步研究不同細(xì)胞類型的策略。為了證明這種方法的有效性，利用這些信息，還確定了在健康肝臟中驅(qū)動(dòng)不同肝巨噬細(xì)胞表型的保守空間相關(guān)信號(hào)。

Results

A practical proteogenomic atlas of the murine liver

為了生成肝臟的蛋白質(zhì)基因組圖譜，首先檢查了檢索所有肝細(xì)胞的最佳方法。 使用鼠肝臟，使用通過離體或體內(nèi)酶消化分離的細(xì)胞與單核 RNA 測(cè)序 (snRNA-seq) 比較了單細(xì)胞 RNA 測(cè)序 (scRNA-seq)。 使用每種技術(shù)，我們都觀察到了不同的細(xì)胞組成（看來單細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組和單核轉(zhuǎn)錄組表征細(xì)胞豐度上還是有差異）。

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• 注： UMAPs showing annotations of cell-types and proportions of each cell type as a % of total cells in the UMAP isolated using (A) ex vivo digestion; 13144 cells, (B) in vivo digestion; 19428 cells and (C) nuclei; 8583 nuclei. (D) Average number of genes/cell in the annotated macrophage population following each isolation method.

雖然 snRNA-seq 產(chǎn)生的基因/細(xì)胞數(shù)量少于 scRNA-seq，但它最好地概括了體內(nèi)觀察到的細(xì)胞頻率

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• 注： (E-J) Confocal microscopy images to determine true abundance of (E) fibroblasts and cholangiocytes (F) endothelial cells, (G) macrophages, (H) dendritic cells, (I) B cells and (J) T cells in vivo. Scale bar 200μm. (K) The percentage of each population was calculated based on the percentage of a given population divided by the total number of nuclei. A threshold was applied to the DAPI channel (picture 1) in ImageJ (picture 2) and nuclei were automatically counted based on the ImageJ ‘a(chǎn)nalyze particles’ plugin (size (micron^2 = 10-1000; circularity = 0-1; picture 3). Due to the density of some liver zones, some nuclei were not automatically counted (arrow, picture 3)。Those were then manually counted and added to the total number of nuclei. For the populations of interest, cells were counted manually based on specific markers (for example, CD3 for T cells, picture 4). Counting was performed blinded prior to analysis of the sequencing results. (L) Proportion of indicated cell types as a % of total cells identified in confocal microscopy images. Data are from 3-7 images per cell type taken from 2-4 mice.

鑒于每種方法的不同細(xì)胞組成，為確保所有細(xì)胞都可以進(jìn)行分析，選擇在我們的研究中使用所有protocol的組合。 為了在單細(xì)胞分辨率下研究 mRNA 和蛋白質(zhì)表達(dá)，通過測(cè)序 (CITE-seq) 使用轉(zhuǎn)錄組和表觀的細(xì)胞indexing。 因此，用 107-161 寡偶聯(lián)抗體對(duì)選定的 scRNA-seq 樣本進(jìn)行染色。將數(shù)據(jù)匯集在一起進(jìn)行單一分析，其中使用 TotalVI 將蛋白質(zhì)和 mRNA 譜都考慮用于聚類。

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• 注：(A) Hepatic cells were isolated from healthy C57B/l6 mice by ex vivo (5 mice, 15 samples) or in vivo (5 mice, 19 samples) enzymatic digestion. Alternatively, livers were snap frozen and nuclei isolated by tissue homogenization (4 mice, 12 samples). Live cells/intact nuclei were purified using FACS. For cells, total live, live CD45+, live CD45-, live hepatocytes or myeloid cells (live CD45+,CD3-, CD19-, B220-, NK1.1-) were sorted. 18 cell preparations (7 ex vivo, 11 in vivo) were also stained with a panel of 107-161 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 185894 cells/nuclei were clustered using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data

對(duì)差異表達(dá)的基因和蛋白質(zhì)的分析確定了 17 種細(xì)胞類型。 此外，確定了所有細(xì)胞的表面標(biāo)志物，包括Kupffer細(xì)胞 (KCs) 的 VSIG4 和 FOLR2。

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• 注：(A,B) Top DEGs (A) and DEPs (B) for cell types identified in Fig. 1B. (C) Distinct profiles of cells or nuclei within the UMAP depending on isolation protocols; 71162 cells from ex vivo digestions, 96066 cells from in vivo digestions and 18666 nuclei. (D) Expression of VSIG4, CD206 and ESAM (protein, top) and Vsig4, Mrc1 and Esam (mRNA, bottom).

Distinct spatial orientation of hepatic myeloid cell subsets

為了定位鑒定出的細(xì)胞，使用 Visium 進(jìn)行了空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析。 為此，以兩個(gè)不同的方向切割肝臟，以描繪肝臟組織和被膜

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• 注： Tissue and capsule images from Visium analysis with clusters overlaid.

沿著空間軌跡對(duì)每個(gè) Visium 點(diǎn)進(jìn)行排序，并根據(jù)已知的肝細(xì)胞分區(qū)標(biāo)記對(duì)入口、門靜脈周圍、中部和中央?yún)^(qū)域進(jìn)行注釋

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• 注：(D) UMAP of zonation of Visium spots (left) & origin of the cells (right). (E) Zonation pattern
  mapped onto tissue slice

通過使用參考 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)，我們將每個(gè)點(diǎn)解卷積為其組成細(xì)胞類型，并研究細(xì)胞豐度如何隨分區(qū)變化

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• 注： Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data

據(jù)報(bào)道，驗(yàn)證這種方法時(shí)，膽管細(xì)胞專門映射到門脈區(qū)，而 KCs 位于門脈周圍和中間區(qū)。 此外，我們?cè)谒袇^(qū)域都發(fā)現(xiàn)了 T 細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞 (EC) 和基質(zhì)細(xì)胞 (SC)，而在門靜脈中發(fā)現(xiàn)了常規(guī)樹突狀細(xì)胞 (cDC)，在中央靜脈中發(fā)現(xiàn)了少量存在。

為了以單細(xì)胞分辨率驗(yàn)證這些位置，接下來試圖確定也可以通過共聚焦顯微鏡工作的最佳細(xì)胞特異性表面標(biāo)記。 由于用于共聚焦顯微鏡的固定步驟通常會(huì)影響不同表位的完整性，因此無法預(yù)測(cè)哪些在單細(xì)胞懸液上起作用的抗體將在固定和完整組織上起作用。 因此，為了同時(shí)篩選多種抗體以識(shí)別通過顯微鏡起作用的抗體，進(jìn)行了第二次 Visium 分析，并補(bǔ)充了 100 種寡偶聯(lián)抗體（Visium 高度多重蛋白），這些抗體是根據(jù) CITE-seq 結(jié)果選擇的。

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• 注： mRNA zonation pattern in Visium Highly-Multiplexed Protein analysis and VSIG4-ADT expression pattern (left) and zonated expression patterns of indicated antibodies (right).

然后，使用 MACSimaTM 成像循環(huán)染色 (MICS) 技術(shù)和 60 重抗體panel，以單細(xì)胞分辨率驗(yàn)證在空間上起作用的抗體

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• 注：MICS analysis of indicated proteins and cell types. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types

Unfortunately，無法為所有populations識(shí)別出有用的表面標(biāo)記，例如，沒有識(shí)別出足夠的區(qū)分性表面標(biāo)記，這些標(biāo)記可以通過共聚焦顯微鏡在空間上區(qū)分 cDC 亞群。 因此，為了確認(rèn)這些細(xì)胞亞群的位置，求助于允許 100 重空間 mRNA 分析的 Molecular Cartography^TM (Resolve BioSciences)。 基于來自 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)的 DEG 選擇基因，這些數(shù)據(jù)也根據(jù) Visium 進(jìn)行了空間解析。 還使用膽管細(xì)胞基因（Epcam、Spp1）和已知的分區(qū)肝細(xì)胞基因（Glul、Cyp2e1、Hal、Sds）確定了該數(shù)據(jù)集中的portal-central軌跡

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• 注： (F) Top unbiased genes defining zonation trajectory from portal to central vein in Visium.(H) Molecular Cartography showing expression of indicated zonated hepatocyte mRNAs in liver tissue. Data are representative of 2 mice.

使用 Xcr1、Clec9a (cDC1s) 和 Cd209a、Mgl2 和 Clec10a (cDC2s) 的表達(dá)，我們證實(shí) cDC1s 和 cDC2s 主要位于門靜脈

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• 注：Molecular Cartography of indicated genes and cell types

由于 cDC2s 與單核細(xì)胞衍生的細(xì)胞共享許多基因，還檢查了一般單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞（Cd14、Adgre1、Axl、Mafb、Cx3cr1、C5ar1）和 KC 特異性基因（Cd5l、Vsig4）的表達(dá)，to further validate their identification as bona fide cDC2s.。 該分析進(jìn)一步表明，鑒定的 cDC2s 是真正的 cDC2s，缺乏任何巨噬細(xì)胞/單核細(xì)胞標(biāo)志物，然而，它還鑒定了不同于 KCs 和 cDC2s 的門靜脈和中央靜脈巨噬細(xì)胞群。這些分析中 mRNA 表達(dá)的punctate nature與髓樣細(xì)胞的樹突形狀相結(jié)合，使得很難令人信服地確定細(xì)胞邊界并得出結(jié)論，這些 cDC2 和巨噬細(xì)胞是不同的細(xì)胞。 為了驗(yàn)證這一點(diǎn)，開發(fā)了一種將 mRNA 檢測(cè) (RNAScope) 與表面蛋白檢測(cè)相結(jié)合的protocol。 結(jié)合蛋白質(zhì)表面標(biāo)記檢查 cDC 或巨噬細(xì)胞特異性 mRNA 的表達(dá)證實(shí)了門靜脈 cDC1、cDC2 和非 KC 巨噬細(xì)胞的存在

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• 注： mRNA (Xcr1, Flt3l, Mafb and Clec10a) and protein (MHCII and F4/80) expression in the same tissue slice. Scale bar 50μm. PV; portal vein, CV; central vein. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

總之，通過結(jié)合多種空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)方法，定位了小鼠肝臟內(nèi)的所有細(xì)胞，并確定了骨髓細(xì)胞內(nèi)的額外異質(zhì)性，在單獨(dú)檢查 sc/sn-RNA-seq 數(shù)據(jù)集時(shí)沒有發(fā)現(xiàn)。 這突出了結(jié)合單細(xì)胞和空間蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)來研究細(xì)胞異質(zhì)性的力量。

Refined analysis of myeloid cells identifies three subsets of hepatic macrophages

為了更好地理解這些非 KC 巨噬細(xì)胞，我們?cè)诙x 11 個(gè)群體的 sc/snRNA-seq 分析中zoomed in骨髓細(xì)胞（cDC、KC、單核細(xì)胞和單核細(xì)胞衍生細(xì)胞）

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這包括 KC、3 組非 KC 巨噬細(xì)胞和細(xì)胞，其特征介于單核細(xì)胞和 patrolling monocytes 或巨噬細(xì)胞之間，稱為過渡單核細(xì)胞。 對(duì)非 KC 巨噬細(xì)胞的仔細(xì)檢查發(fā)現(xiàn) cluster6 是腹膜巨噬細(xì)胞。 其余clusters之間的 DEG 表明 cluster7 可能類似于膠囊巨噬細(xì)胞，表達(dá) Cd207 和 Cx3cr1，而 cluster8 類似于我們最近在脂肪肝中描述的 Gpnmb+Spp1+ 脂質(zhì)相關(guān)巨噬細(xì)胞 (LAMs)。Conversion of the CITE-seq data into a flow cytometry file allowed an gating strategy to be defined.驗(yàn)證這一點(diǎn)，利用該策略來純化cluster并評(píng)估基因表達(dá)。 在消化前清洗肝臟可以使清洗部分中的腹膜巨噬細(xì)胞富集，這表明這些是肝臟表面的污染物，而不是存在于肝臟組織本身中。 雖然 CITE-seq 標(biāo)記不能區(qū)分cluster 7 和 8，但在panel中添加 CD207 使非 KC 能夠分為 CD207+ 和 CD207- 巨噬細(xì)胞。 與它們被稱為膠囊巨噬細(xì)胞的名稱相吻合，如果解剖和消化膠囊，CD207+ 巨噬細(xì)胞的相對(duì)豐度就會(huì)增加。 然而，盡管分子圖譜證實(shí)了膠囊中存在 Cd207+ 巨噬細(xì)胞，但它也揭示了中央靜脈的 Cd207+ 巨噬細(xì)胞，而門靜脈很少發(fā)現(xiàn)這種巨噬細(xì)胞.

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• 注： (E) Expression of VSIG4 and F4/80 (left) or MHCII, CD11c and DAPI (right) by confocal microscopy. Capsule macrophages (left) or MHCII+ capsule macrophages (right) identified by white arrows. Scale bar 50μm. (F) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at liver capsule. (G) Expression of VSIG4, F4/80, GLUL and DAPI (left) or F4/80 or CCR2 (right, inset) by confocal microscopy. Scale bar 100μm. (H) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at portal triad. PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

因此，cluster7 由囊和中央靜脈 CD207+ 巨噬細(xì)胞組成。 這一發(fā)現(xiàn)進(jìn)一步證明需要空間方法來確認(rèn)細(xì)胞身份，因?yàn)檫@種特征以前被認(rèn)為是膠囊巨噬細(xì)胞群所獨(dú)有的。 分子圖譜還在門靜脈和中央靜脈處鑒定出巨噬細(xì)胞，表達(dá) Ccr2 和 Chil3，類似于過渡單核細(xì)胞（cluster11）。 最后，發(fā)現(xiàn)一群表達(dá) Gpnmb 的巨噬細(xì)胞專門位于膽管周圍。 由于 Gpnmb 表達(dá)是 cluster8 特異性的，并且這些細(xì)胞類似于 LAM，我們將這些細(xì)胞稱為膽管 LAM。

Macrophage subsets reside in distinct spatial niches

由于所有巨噬細(xì)胞群都與其局部環(huán)境中的 CD45- 細(xì)胞密切接觸，進(jìn)一步分析了 CD45- 細(xì)胞，確定了 EC 和 SC 的多個(gè)亞群以及區(qū)分它們的gating strategy。EC 可以進(jìn)一步細(xì)分為 4 個(gè)不同的cluster，對(duì)其位置的分析使它們能夠被識(shí)別為中央靜脈 EC（cluster 10）、LSEC（cluster 9）、門靜脈 EC（cluster 11）和淋巴 EC（LEC；cluster 12）。由于 Visium 在門靜脈和中央靜脈中都發(fā)現(xiàn)了成纖維細(xì)胞，并且正如之前的一份報(bào)告表明這些細(xì)胞中存在不同的亞群，我們進(jìn)一步分析 SCs 以更好地評(píng)估它們的異質(zhì)性。 這揭示了僅限于膠囊的間皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的亞群。 Myh11+ 血管平滑肌細(xì)胞 (VSMCs) 位于肝動(dòng)脈、門靜脈和中央靜脈周圍，發(fā)現(xiàn) Mfap4+Svep1+Clic5-Reln-成纖維細(xì)胞是中央靜脈成纖維細(xì)胞。 最后，確定了位于膽管細(xì)胞周圍的 Clic5+Reln+ 成纖維細(xì)胞 (cluster3) 的一個(gè)subset，將其稱為膽管成纖維細(xì)胞。 總之，這些空間上不同的 ECs 和 SCs 子集的存在突出了不同巨噬細(xì)胞種群所在的特定微環(huán)境的獨(dú)特性。

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• 注：Hepatic macrophage populations reside in distinct niches。(A) UMAP of murine CD45- cells (83410 cells/nuclei) isolated from Fig. 1B and re-clustered with TotalVI. (B,C) Top DEGs (B) and DEPs (C) between cell types identified. (D) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto the Visium zonation data. (E) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at central vein (left) and 2 different portal triads (center and right). (F) UMAP of murine stromal cells (5430 cells/nuclei) isolated from the UMAP in Fig. 3A and reclustered with scVI. (G) Top DEGs between different cell types identified. (H) Identification of Mesothelial cell (top) and VSMC (bottom) signatures on zonated Visium data. (I) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the liver capsule. (J) Molecular Cartography of indicated genes and cell types at the central vein (left) and portal triad (right). PV; portal vein, CV; central vein, HA; hepatic artery and BD; bile duct. Arrows indicate specific cell types, where color corresponds to cell type/markers. All images are representative of 2-4 mice.

A practical proteogenomic atlas of the healthy human liver

為了確定巨噬細(xì)胞亞群之間的保守程度及其在小鼠和人類肝臟之間的不同微環(huán)境生態(tài)位，我們接下來使用 sc/snRNA-seq 和 CITE-seq 對(duì) 19 次肝臟活檢生成了人類肝臟的蛋白質(zhì)基因組圖譜。其中，大多數(shù)在組織學(xué)上是健康的，只有 5 名患者表現(xiàn)出>10% 的肝脂肪變性。細(xì)胞比例因所使用的隔離技術(shù)而異，雖然患者之間存在一些差異，但這與手術(shù)無關(guān)。由于 Visium 可靠地定位了鼠肝細(xì)胞，我們使用它來定位 4 次活組織檢查中的人類肝臟細(xì)胞。由于>10% 脂肪變性的患者與健康樣本（<10% 脂肪變性）分開聚集，使用健康樣本來計(jì)算基線分區(qū)，然后將此軌跡轉(zhuǎn)移到脂肪變性樣本上。這確定了這些患者的脂肪變性主要位于中心周圍。這與之前的臨床研究相吻合，即中央周圍脂肪變性在 NAFLD 患者中最常見，尤其是在門靜脈周圍區(qū)域通常不受累的早期疾病中。值得注意的是，盡管中性粒細(xì)胞優(yōu)先位于脂肪變性區(qū)，但整體細(xì)胞分布不受中央周圍脂肪變性的影響

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• 注：Identification of bona fide Kupffer cells across species 。(A) Cells or nuclei were isolated from liver biopsies (~1-2mm3; 14 cells, 5 nuclei) from patients undergoing either liver resection, cholecystectomy or gastric bypass. Live cells/intact nuclei were purified using FACS. Either total live, live CD45+, live CD45- or lineagecells (live CD45+,CD3-,CD19-) were sorted. 7 cell samples were stained with a panel of 198 barcode-labelled antibodies for CITE-seq analysis. All datasets were pooled together and after QC 167598 cells/nuclei were analyzed using TotalVI. (B) UMAP of sc/snRNA-seq data. (C) UMAP of Visium data from 4 patient biopsy samples. (D) Split of Visium spots based on %steatosis. (E) Healthy and steatotic Visium liver tissue with clusters overlaid and H+E staining to identify steatotic zones. (F) Zonation of Visium data (top) with zonation pattern mapped onto liver tissue (bottom). (G) Indicated cell signatures from sc/snRNA-seq mapped onto Visium zonation trajectory, healthy (top), steatotic (bottom).、

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An evolutionarily-conserved program of KCs

迄今為止，還沒有描述真正的人類 KCs 的經(jīng)過驗(yàn)證的標(biāo)記。在解釋準(zhǔn)確定義人類 KCs 的困難時(shí)，發(fā)現(xiàn)單核細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在人類 sc/snRNA-seq 數(shù)據(jù)中形成了一個(gè)單一的連續(xù)體，阻止了人類 KCs 的簡(jiǎn)單定義。為了進(jìn)一步研究潛在的人類肝臟巨噬細(xì)胞異質(zhì)性，我們分析了骨髓細(xì)胞，確定了 10 個(gè)cluster。為了定義 KC，接下來檢查了這些cluster對(duì)前 25 個(gè)鼠類 KC 基因的表達(dá)，這些cluster確定了 cluster10 是真正的人類 KC。與小鼠不同，它們優(yōu)先位于中間區(qū)域。 Cluster9 也表達(dá)了許多這些基因，但缺乏 TIMD4，這表明這些細(xì)胞可能是最近招募的單核細(xì)胞衍生的 KCs (moKCs)。盡管單獨(dú)的 VSIG4 表達(dá)不能準(zhǔn)確識(shí)別人類肝臟中的 KC，但發(fā)現(xiàn) VSIG4 蛋白是 CITE-seq 數(shù)據(jù)中人類 KC 的最佳標(biāo)記物，突出了檢查表面蛋白質(zhì)組和轉(zhuǎn)錄組的重要性。這通過流式細(xì)胞術(shù)和對(duì)人肝臟的 VSIG4 和 KC 特異性基因 CD5L 的共染色進(jìn)行了驗(yàn)證，這也證實(shí)了它們的中帶定位。為了評(píng)估 KC 身份在進(jìn)化中是否進(jìn)一步保守，對(duì)獼猴、豬、倉鼠、雞和斑馬魚的肝臟進(jìn)行了分析。我們通過將保守的人-鼠 KC 簽名映射到數(shù)據(jù)集上，以無偏見的方式識(shí)別了 KC。然后檢查了確定的每個(gè) KC 群體的主要特征。觀察到跨物種轉(zhuǎn)錄組的強(qiáng)烈重疊可能是由于核心 KC 轉(zhuǎn)錄因子的保守表達(dá)。 VSIG4 蛋白表達(dá)在豬和獼猴 KCs 中也是保守的。同樣，還能夠根據(jù)保守基因識(shí)別跨物種的大多數(shù)其他肝細(xì)胞。 cDC2s 是主要的例外，因?yàn)樘囟ǖ?cDC2 標(biāo)記基因并非在所有物種中都是保守的。

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LAM location is altered in the steatotic human liver

除了 KCs，還在肝囊中發(fā)現(xiàn)了人類 CD68+VSIG4-巨噬細(xì)胞，靠近中央靜脈和門靜脈以及膽管。在健康獼猴肝臟的門靜脈和中央靜脈以及膽管中也觀察到了類似的populations 。檢查 scRNA-seq 數(shù)據(jù)并與小鼠特征進(jìn)行比較，確定了未成熟和成熟的 LAM，從而能夠定義保守的 LAM 特征。盡管最近的一項(xiàng)研究表明這些細(xì)胞對(duì)纖維化肝臟具有特異性，但在所有使用 scRNA-seq 分析的患者中都發(fā)現(xiàn)了 LAM，但在 2 個(gè)脂肪變性 >10% 的肝臟中，LAM 的比例有增加的趨勢(shì)。與顯微鏡和鼠膽管 LAM 一致，人類 LAM 位于非脂肪肝的匯管區(qū)。然而，在脂肪變性的人類肝臟中，LAM 主要位于中央周圍，與脂肪變性相關(guān)。在喂食western diet (WD) 36 周以誘發(fā)脂肪肝疾病后，在小鼠中使用 Visium 也驗(yàn)證了 LAM 位置的這種變化。在這里，與整個(gè)肝臟存在脂肪變性相吻合，在門靜脈、門靜脈周圍和中間區(qū)域發(fā)現(xiàn)了 LAM。鑒于兩個(gè)物種中 LAMs 的位置與過量脂質(zhì)的存在以及發(fā)現(xiàn) LAMs 的不同位置之間的生態(tài)位細(xì)胞的異質(zhì)性相關(guān)，這表明 LAM 表型和豐度可能受脂質(zhì)暴露而不是特定的在兩個(gè)位置保守的局部細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用。

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Differential NicheNet analysis across species reveals a crucial role for the ALK1-BMP9/10 axis in KCs.

為了評(píng)估保守的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用與局部代謝物（如脂質(zhì)）在推動(dòng)跨物種巨噬細(xì)胞異質(zhì)性方面的作用，我們?cè)诓煌母尉奘杉?xì)胞和存在于各自nichs中的 CD45-細(xì)胞之間進(jìn)行了差異 NicheNet 分析，重點(diǎn)是配體和在人和小鼠中都保守的受體。與 KCs 相比，這揭示了 LAMs 的特定配體 - 受體對(duì)很少，進(jìn)一步暗示驅(qū)動(dòng) LAM 表型的主要信號(hào)可能不是來自獨(dú)特的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用。與此一致，用乙?；兔芏戎鞍着囵B(yǎng)的 BM 單核細(xì)胞表達(dá) LAM 相關(guān)基因，表明脂質(zhì)在誘導(dǎo) LAM 表型中起主導(dǎo)作用。對(duì)形成 KC 生態(tài)位藍(lán)圖的細(xì)胞串?dāng)_的進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，人和小鼠之間存在多個(gè)保守的配體-受體對(duì)。其中一個(gè)，KCs（ALK1；由 Acvrl1 編碼）和星狀細(xì)胞（分別由 Gdf2/Bmp10 編碼的 BMP9/10）之間的 ALK1-BMP9/10 回路被發(fā)現(xiàn)在所有 7 個(gè)物種中都是保守的，并被預(yù)測(cè)控制表達(dá)許多保守的 KC 轉(zhuǎn)錄因子。為了驗(yàn)證這個(gè)軸，我們生成了 Fcgr1-Cre x Acvrl1fl/fl 小鼠，從巨噬細(xì)胞中消除了 ALK1。這導(dǎo)致 VSIG4+ KCs 幾乎完全喪失，表明進(jìn)化上保守的 ALK1-BMP9/10 軸對(duì)于肝臟中 KC 的存在至關(guān)重要。

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Discussion

為了生成任何人體組織的實(shí)用細(xì)胞圖譜并解開對(duì)居住在該組織中的細(xì)胞的身份至關(guān)重要的細(xì)胞-細(xì)胞回路，需要四個(gè)關(guān)鍵信息：（i）存在的所有細(xì)胞的清單，（ii）位置 組織內(nèi)不同細(xì)胞之間的相互作用，以識(shí)別相鄰細(xì)胞之間的相互作用，(iii) 人類和動(dòng)物模型之間的alignment，允許任何預(yù)測(cè)的細(xì)胞 - 細(xì)胞相互作用受到干擾，以及 (iv) 識(shí)別可靠的基于抗體的panel有效篩選不同患者和/或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物。 在這里，通過整合單細(xì)胞和空間轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)數(shù)據(jù)，為肝臟提供了這 4 條信息，并揭示了控制肝臟巨噬細(xì)胞發(fā)育的進(jìn)化上保守的microenvironmental circuits。
強(qiáng)調(diào)需要結(jié)合不同的分離策略來正確分析所有肝細(xì)胞，證明如果沒有 scRNA-seq 和 snRNA-seq 的組合，肝臟圖譜中將缺乏不同的人和鼠基質(zhì)細(xì)胞亞群。解開所有肝細(xì)胞的空間定位，確定了健康小鼠、人類和獼猴肝臟膽管周圍的 LAM。然而，當(dāng)存在脂肪變性時(shí)，LAMs 會(huì)擴(kuò)張并定位到脂肪變性的周圍區(qū)域，這讓人想起 LAMs 在肥胖小鼠肝臟中的擴(kuò)張。這種空間信息至少部分否定了 LAM 身份是由纖維化基質(zhì)細(xì)胞特異性誘導(dǎo)的假設(shè)，并支持 LAM 主要由局部脂質(zhì)暴露誘導(dǎo)的概念，正如在實(shí)驗(yàn)中所證明的那樣。盡管脂質(zhì)的確切來源仍有待確定。還提供了七個(gè)物種的肝臟圖譜的對(duì)齊方式。這揭示了穩(wěn)態(tài) KCs 的保守轉(zhuǎn)錄組程序，并揭示了 KCs 與構(gòu)成其生態(tài)位的細(xì)胞之間的空間限制和保守的配體-受體對(duì)。強(qiáng)調(diào)在試圖了解疾病如何擾亂細(xì)胞之前首先表征健康組織的必要性，我們將 DLL-NOTCH 相互作用確定為穩(wěn)態(tài) LSEC 和 KC 之間進(jìn)化保守的串?dāng)_，因此并非肝細(xì)胞癌或纖維化所獨(dú)有，正如最近提出的那樣。同樣，發(fā)現(xiàn) FOLR2 表達(dá)不是腫瘤相關(guān)肝巨噬細(xì)胞所特有的，而是在健康小鼠和人類肝臟的 KCs 上表達(dá)（mRNA 和蛋白質(zhì)）。最后，應(yīng)用蛋白質(zhì)基因組學(xué)管道，從廣泛的寡偶聯(lián)抗體面板開始，用于單細(xì)胞和空間分析。這是至關(guān)重要的，因?yàn)檗D(zhuǎn)錄組分析并不總是與通過流式細(xì)胞術(shù)或顯微鏡檢測(cè)蛋白質(zhì)的能力相對(duì)應(yīng)。通過廣泛篩選，確定了分離和定位肝巨噬細(xì)胞及其各自生態(tài)位細(xì)胞的最佳表面標(biāo)志物。這既可以驗(yàn)證單細(xì)胞水平的空間位置，也可以有效篩選轉(zhuǎn)基因小鼠模型的 KCs 損失。使用定義的panel對(duì) Fcgr1-CrexAcvrl1fl/fl 小鼠的表征很容易證明 ALK1-BMP9/10 軸在 KCs 中的重要性，強(qiáng)調(diào)巨噬細(xì)胞-成纖維細(xì)胞的串?dāng)_比生長(zhǎng)因子的交換更進(jìn)一步。展望未來，將這些相對(duì)便宜的抗體組應(yīng)用于大型患者隊(duì)列或多個(gè)轉(zhuǎn)基因小鼠模型應(yīng)該能夠有效識(shí)別任何擾亂肝臟穩(wěn)態(tài)的擾動(dòng)。

Methods(關(guān)注一些關(guān)鍵的方法)

Probabilistic graphical modelling （Modelling of Visium data ）

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Reference for deconvolution

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Deconvolution

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Differential abundance along zonation

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生活很好，有你更好