PCR引物是指在PCR反應中與待擴增的靶DNA區(qū)段兩翼互補的寡聚核苷酸，其本質(zhì)是單鏈DNA片段。PCR引物的選擇對PCR成功與否具有決定性意義，因此，引物的設計需要遵循一些基本原則：
引物長度：一般為15~30個堿基，過短會降低擴增特異性，過長會提高退火溫度和引物自身結(jié)合的可能性。
引物序列：應與靶DNA完全互補，避免錯配或雜交。應盡量避免數(shù)個嘌呤或嘧啶連續(xù)排列，避免同源序列（尤其6個堿基以上相同）。
引物結(jié)構(gòu)：應避免引物自身形成發(fā)夾狀或回文狀的二級結(jié)構(gòu)，影響引物與模板的復性結(jié)合。應避免兩個引物之間形成互補或二聚體，影響擴增效率和特異性。
引物GC含量：一般為40%~60%，兩條引物的GC含量應盡量相似。GC含量過低會使引物不穩(wěn)定，過高會導致非特異性擴增或難以解鏈。
引物Tm值：即解鏈溫度，與引物長度、GC含量和堿基組成有關。一般為50~65℃，兩條引物的Tm值應盡量接近，差異最好在1℃以內(nèi)，最多不超過5℃。
引物3’端：是延伸開始的地方，因此要防止錯配或二級結(jié)構(gòu)。3’末端最后一個堿基最好是G或C，增加引物的特異性和穩(wěn)定性。
引物5’端：限定了PCR產(chǎn)物的長度，對擴增特異性影響不大，因此可以被修飾或添加標記、位點等，以便于后續(xù)的檢測、分析或克隆等操作。
引物位置：應盡量選擇靶DNA的保守區(qū)域，避免變異或多態(tài)性的影響。如果可能，應跨越內(nèi)含子或非編碼區(qū)域，以區(qū)分基因組DNA和cDNA。如果擴增的是已知的基因或序列，應避免選擇含有重復序列或低復雜度序列的區(qū)域。
引物濃度：一般為0.1~1 μM，以最低引物量產(chǎn)生所需結(jié)果為好。引物濃度過高會引起錯配和非特異性擴增，增加引物間二聚體的形成機會。
以上就是PCR引物設計原則的文章，希望對你有所幫助。
