引物設計原則
一、Tm值
sense primer和anti-senseprimerTm溫差最好不超過2度。
二、GC% GC含量
對于PCR反應來說GC含量在40%—60%，一般50%左右比較合適；而對于測序引物和雜交探針來說GC含量至少應為50%。產物中GC含量最好大于引物中的GC含量。三、Degeneracy 多義性
當設計多義引物時應盡量減少引物多義性，這樣會帶來更好的特異性，應盡量避免3’末端的多義性，因為這里即使一個堿基的錯配都能阻止引物延伸。四、3’ End Stability 3 末端穩定性
3’端避免以A結尾，最好是G或者C，T也可以；3’避免出現連續的3個堿基相連的情況，比如GGG或 CCC，否則容易引起錯配；引物穩定性影響它的錯配效率，一條理想的引物應該有一個穩定性較強的5 末端和相對穩定性較弱的3’末端。如果引物3’穩定性強，有可能在即使5’末端不配對的情況下造成錯配，形成非特異性擴增條帶（secondary bands） 。而3 末端穩定性低的引物較好的原因是在引物發生錯配時，由于3’末端不太穩定引物結合不穩定而難以延伸。五、GC Clamp GC鉗
引物與目的位點的有效結合需要有穩定的5’末端。這一段有較強穩定性的5’末端稱為GC鉗。它保證引物與模板的穩定結合。選擇有合適穩定性的引物能在確保不產生非特異性條帶的前提下盡量降低退火溫度。
六、Secondary Structures 二級結構
二級結構是引物設計中必須考慮的一個重要因素。二級結構能顯著影響反應中能與模板正確結合的引物數量，發卡結構的存在能限制引物與目的位點的結合能力，從而降低擴增效率，形成發卡環的引物則不能在PCR擴增中發揮作用。
七、Hairpin 發卡結構
發卡結構的形成是由于引物自身的互補堿基分子內配對造成引物折疊形成的二級結構，并由于發卡結構的形成是分子內的反應,僅僅需要三個連續堿基配對就可以形成。發卡結構的穩定性可以用自由能衡量。自由能大小取決于堿基配對釋放的能量以及折疊DNA形成發卡環所需要的能量，如果自由能值大于0 則該結構不穩定從而不會干擾反應，如果自由能值小于0 則該結構可以干擾反應。
八、Dimer 二聚
引物之間的配對區域能形成引物二聚體，它是相同或不同的兩條引物之間形成的二級結構。它造成引物二聚體擴增并減少目的擴增產物，二聚體可以在序列相同的兩條引物或正反向引物之間形成，如果配對區域在3’末端問題會更為嚴重，3’末端配對很容易引起引物二聚體擴增。
九、False Priming 錯配
如果引物可以結合除目的位點外的其他區域，擴增效率將明顯降低目的產物帶將減少或出現涂布（smear）。3’末端連續幾個堿基配對形成錯配的傾向要高于引物上游區域同樣數量的堿基配對，在使用引物設計軟件時，您可以分別設定確認為錯配的3’末端或引物全長形成連續堿基配對的數量。
十、結果參數查看
引物報告參數說明
Rating：引物得分（滿分100：得分越高引物設計的越合理）
Seq No：引物序列在DNA序列上的起點位置
Length：序列長度
Tm[ °C]：DNA解鏈溫度
GC%：GC百分含量
?????G[kcals/mol]：反映引物和模板結合強弱的程度??
A ****ctivity[****μ****g/OD]：引物的吸光度值
Degeneracy：多義性
