Hansen O K, McKinney L V. 2010. Establishment of a quasi-field trial in Abies nordmanniana-test of a new approach to forest tree breeding. Tree Genetics and Genomes, 6(2): 345–355.

本研究使用DNA標記在由開放授粉的克隆種子果園（CSO）中收集的種子生產的生產圣誕樹架內建立類似野外試驗。共有來自CSO的660名后代，其中包含99個克隆的Abies nordmanniana，用12個微衛星進行基因分型。親子被成功分配到93％和98％的后代，分別為95％和80％的置信度。當標記數減少到10時，轉讓率只下降到90％。在CSO克隆中，子代對子代的分配高度偏差。在7％的病例中，最成功的克隆被分配為父母，119個潛在親本基因型中只有92個被分配為父母。所獲得的譜系用于估計與圣誕樹育種相關的五個字符的CSO克隆的育種值。對于高遺傳性狀，例如萌芽，可以估計相當大比例的克隆的準確的育種值。對于估計低遺傳性狀（如圣誕樹質量評分）的育種價值，將需要更多的基因型后代。該方法的最大缺點是種子果園中父母間親屬分布偏高，難以計算所有克隆的育種值。該方法似乎非常適合于樹木育種，更重視純種選擇的親本基因型，而不是估計定量遺傳參數。

前言

世界上最先進的針葉樹育種計劃僅在第三代或第四代（Pinus taeda，Pinus radiata，Pseudotsuga menziesii; Yanchuk 2004）。這與農作物育種形成鮮明對照，農作物育種具有悠久的馴化歷史，具有數十甚至數百個繁殖世代。【原因】起步晚：這種差異有很多原因;一個明顯的原因是選擇性樹種育種直到二十世紀中葉才開始（Burley 2004）。另一個因素是樹木育種的長期期限，生成周期長。樹種繁殖涉及需要大量空間和工作人員的大型生物，所有這些都投入到三至四十年的希望中。此外，林業產品的多樣性大于農業（Namkoong等，1988）。無論樹種繁育的起因如何，似乎至少在許多西方國家，已經通過了樹種育種的全盛時期。在這些地區，有傳統育種計劃資金減少的趨勢，體制和經濟變化改變了傳統的森林樹種育種方法，例如，通過將合作結構置于壓力之下，縮短計劃范圍，并從現場工作轉向生物技術（Burdon，2004）。這是我們研究的背景，這表明通過利用生物技術來幫助縮短規劃范圍，同時仍然使用定量育種方法。基本思想是使用分子標記物以更靈活的方式建立現場試驗，從而避免傳統方法的一些風險和精細的組成部分。這種新方法通過在種子果園后代的生產機構中的親本分析建立了已知的關系，并隨后在定量遺傳分析中分析了樹木。其他人也有同樣的想法，最近El-Kassaby等人（2007）介紹了他們的“繁殖沒有繁殖”的方法。我們的方法是“準實地試驗”。

準場試驗的一個先決條件是出現了高度多態性的DNA標記，如微衛星，可以揭示種子果園中的精確授粉模式（例如，Moriguchi等人，2004）。其他的則是最大可能性方法的發展（例如Searle 1995），以及ASReml（Gilmour et al。2006）等匹配軟件，可以估計非常不平衡的交叉方案的方差分量，這些方法通常是公開授粉的后代的結果。除了這些創新之外，越來越多的基因座對大量個體進行基因分型的發展，并以更低的成本提取DNA也使得該方法的實際應用成為現實?？紤]到這些領域的最新發展，已經可以通過我們這樣的研究來說明這種方法的優勢。

由于建立和測量之間的長時間，樹種育種人員經常失去田間試驗，才能產生任何結果?？赡芷茐纳忠巴庠囼灥囊恍┎恍野ㄉ只馂?，風暴，冰暴，昆蟲，動物和疾病的破壞，城市轉型和破壞行為（Libby等，1969）。在我們的圣誕樹育種計劃中，由于鹿的瀏覽或春季霜凍，現場試驗已經失敗，這兩種情況都可能嚴重破壞樹木，并使后期的實地測量毫無意義。所有這些事件中的共同點是，建立現場審判的費用已經得到支付（例如跟蹤單獨的種子批，每個個人/家庭的標簽和注冊以及制作實地審判報告），而沒有得到任何結果。準場試驗的最大優點之一是它們的靈活性和不依賴于連續性。與傳統的現場試驗相反，需要工作人員和機構資源來建立試驗，多年后進行維護和分析，可以同時完成對準實地試驗的建立和開采，從而降低資源浪費的風險，從未測量過可以在收集基因分型樣品的同時測量準場試驗，從而完全消除風險。如果傳統的實地試驗失敗，可能沒有第二個選擇來獲得結果。另一方面，來自克隆種子果園（CSO）的種子可能導致許多生產臺，從而提供幾種選擇來建立準實地試驗。
此外，該方法促進了替代選擇和測量方案，其中僅選擇生產臺的次要子集（最佳個體）并進行基因分型。這項研究的目的是通過使用DNA標記和親本分析來測試一種新的樹種育種方法，以建立準野外試驗并估計育種基因型的育種價值。該研究使用了丹麥諾德曼尼亞（Nordmann fir）的一個CSO，它是一種在丹麥生長的異乎尋常的針葉樹，用于生產圣誕樹。討論了使用準場試驗的一般問題和觀點。

討論和結論

使用分子標記物來估計定量遺傳參數的想法是長期的（Thompson 1975; Queller and Goodnight 1989）。 Ritland和Ritland（1996）通過報告黃猴花（Mimulus guttatus）的天然種群，對植物進行了首例研究。
在森林樹木改良中，分子標記已被用作研究來自CSO的種子作物的遺傳組成的工具。檢查不均勻的父親貢獻，自交和花粉污染（Adams和Joly 1980; Muona和Harju 1989）。 Lambeth等人（2001）介紹了使用父親分析法使花粉組合育種成為高成本和邏輯上困難的全同胞雜交方案的有效替代方案。最近的研究通過對來自CSO的田間試驗中的后代進行基因分型，研究了自交和父系失衡對遺傳參數和EBV的影響（Doerksen and Herbinger 2008; Gaspar et al。2009; Hansen and Nielsen 2009）。
然而，使用Grattapaglia等人的親子鑒定檢索桉樹精英父母的回顧性選擇。 （2004）是我們所知道的第一次親子鑒定分析的CSO后代被證明是一種繁殖方法。 El-Kassaby等人（2007）進一步發展和體現了這一想法，他們稱之為“不育育”。我們在El-Kassaby等人出版之前發起了我們的研究。 （2007），但是這種做法是相似的，從而進一步說明了這個概念。
除父母分析外，其他基于DNA的家系重建方法也存在，例如，親屬關系分析，其中包括關系類別的相關性估計和分組（Blouin 2003）。這些方法旨在估計群體水平參數，如遺傳力，交配選擇或基因流。然而，在我們這種情況下，在后向選擇的育種背景下，血統本身是直接的興趣，父母分析成為明顯的選擇。此外，用于估計定量遺傳參數的非基于譜系的標記方法在幾個近交生物研究中已被證明是不精確的（Pemberton，2008）。在父母分析領域，只有分類分配（Jones和Ardren 2003）是真正的興趣，因為我們需要估計特定個體（父母）的育種價值，這又意味著需要一個特定的譜系。

Lundbygaard的親子分析

這項研究在將父母分配給子孫后的成功率很高。當從另一個種子來源的后代被排除在分析之外（第5行和第8行（其中只有82個后代中只有一個可以分配一個父對）時，98％的樹被分配了80％置信度的父對，93％ 95％的信心。兩個置信水平的分配率之間的邊際差異也證實了母體分析的魯棒性。作為對這種健壯性的額外測試，我們在先前分析的A.nordmanniana材料集合（Hansen和Nielsen 2009）中進行了親本分析。這包括一個公開授粉的半同胞試驗，來自CSO，有23個親本克隆，每個由約28棵樹組成，全部都有一個已知的母親，但未知的父親。假定的已知母親和后代之間的基因型不匹配的樹被排除在外，留下了596個我們確定母親身份的后代。然后將母親的身份從數據集中刪除，并且進行了與FP1100后代類似的親子鑒定分析，盡管只有六個微衛星的基因型可用。結果同樣成功，母親對以87％的后代賦予95％的信心。此外，596個人中有15人（97.5％），已知母親被指定為最可能的父母雙親中的父母之一。
這個高成功率的一個原因可能是丹麥針葉樹種子果園的花粉污染通常小于5％（Hansen和Kj？r 2006; Hansen 2008; Hansen和Nielsen 2009）。嫁接克隆和未知“入侵者”之間共享父系的實例不會提供成對的父對對子代的分配。一個解決方案可能是分配一個單親（母親）來估計育種值。高花粉污染將難以估計育種男性人口（NBMP），這是CERVUS家長分析中所需的候選父母數量的一部分。模擬研究表明，NBMP的準確估計對于優化CERVUS的親子鑒定研究的可靠性很重要（Oddou-Muratorio等，2003）。由于花粉污染少，潛在父母的數量將接近CSO的克隆數量，盡管花粉和種子的貢獻不同可能降低這一估計的準確性。
針葉樹種子園中低花粉污染可能是因為在丹麥幾乎沒有土著針葉樹種，只有少數引進的種類大量種植。另外，在諾曼德氏菌（A.nordmanniana）的情況下，通常在開花前一年的時間內將樹木收獲為圣誕樹，通常在28-35年后開始。這在本研究中得到了支撐，因為CSO的根莖在1998年為23歲，當時為Lundbygaard后代收獲種子，而親本分析顯示，長滿根的砧木通常不參與種子生產。在FP1100中，花粉污染也較低。如果我們使用在FP1100中沒有發現父母等位基因的次數，不包括第5行和第8行的樹木，則我們收到20/569 = 3.5％的花粉污染估計值。
El-Kassaby等人（2007）采用了59株克隆的道格拉斯種子果園，花粉污染率達30％以上。這將浪費更多的基因分型努力比我們的研究，但是在許多情況下看到的高花粉污染可能會被補充大量授粉（SMP）抵消，正如Bridgwater等人所提出的。 （1993）。

數量遺傳估計

獲得的遺傳力估計高，除了圣誕樹質量得分。一個大型傳統的田野試驗系列，1997年成立，共有11個場地，單棵樹種植了3萬多棵樹，高度和圣誕樹質量得分分別為0.16和0.10，遺傳率估計（Ulrik Br？uner Nielsen，發現數據）。準實地試驗估計了圣誕樹質量得分完全相同的遺傳力，從而支持這一特征是一個低遺傳特征，許多因素也是環境因素可以影響的。使用準實地試驗的最方便的特征，即避免將單個種子收集物從個別克隆中分離出來并分開分批培育幼苗也可能是其最嚴重的缺點。母親（種子）和父親側（花粉）可能發生的高度偏差的親子鑒定貢獻意味著，CSO中的一些克隆不會有或很少的后代。在公開授粉的半同胞測試的傳統育種方法中，可以通過確保來自每個種子父母的相等數量的幼苗來平衡母親方面的測試方案。在最佳情況下（最高螺旋分支），我們可以在CSO的其余99個克隆中獲得57個準確的EBV（58％），高度為39個克?。?9％），遺傳性狀，圣誕樹質量得分，數量只有兩個。因此，育種者必須考慮在CSO中為所有克隆獲得育種價值的重要性，以及改良性狀。然而，盡管具有準確的EBV的克隆數目遠遠超過克隆總數，但是對于大多數性狀，具有準確EBV的克隆占總親本的75％以上，從而使配子對生產的貢獻。為了增加提供足夠數量的后代的克隆數量，從而增加可靠的EBV，一種可能性是確保SMP的授粉成功。然而，這也需要更多的工作，并要求所有克隆的可用花粉?！具z傳力低怎么辦】在遺傳性極低的性狀的育種中，另一種方法可能是僅在具有所需特性的選定后代中分析親本。
準野外試驗的使用消除了對一些假設的依賴，例如，在公開授粉的后代試驗中假設真正的半同胞，盡管不能實現這一假設的后果很?。℉ansen和Nielsen，2009年）。然而，其他假設仍然是相關的，例如母本效應問題。當進行公開授粉的測試或交配設計時，沒有相互的交叉，假定產婦的影響可以忽略不計。在準場試驗中，我們可能會收到一組父母，但不知道哪位父母是母親，哪位是父親。因此，精確估計育種值對于測量性狀不需要或只有較小的母體效應。規避對這一假設依賴的一種方法可能是包括單方面遺傳的標記。在松果科的針葉樹中，這可以通過線粒體標記（通常是母體遺傳的）或通常是父系來源的葉綠體標記來實現（Wagner 1992）。高度多態性的標記在針葉樹的線粒體DNA中是不可缺少的，但SSR標記已被鑒定并應用于針葉樹葉綠體DNA，而在Abies物種中，它們具有特別高的變異性（Vendramin等人1999; Hansen et al。2005b），所以這可能是確定母親和父親身份的機會。

未來使用類實地試驗和不同的育種策略

該研究旨在獲得盡可能多的FP1100克隆的EBV。然而，在同一領域看到Lundbygaard的40,200個FP1100后代的大型展臺，可能會考慮另一種使用基因分型工作。而不是在一個選定的場地中對650個人進行基因分型，可以通過整個領域進行基因分型，并選擇具有最大圣誕樹質量得分的650棵樹。這也將確定具有良好圣誕樹分數的后代產生的最高概率的克隆，但具有更高的選擇強度。對于高遺傳性狀，該方法只能確定CSO中有限比例的克隆，例如，大多數識別的親本將是100個克隆中的10個克隆中的10個。因此，估計遺傳參數如遺傳因素的意義較小，因為我們正在從有限的部分克隆中測量后代，因此重點將放在純粹的選擇上。在這個意義上說，林木育種將會回歸到基礎，但沒有估計效應的大小。生產臺中選定個體的基因分型的一個缺陷是親屬分布的偏差。如果CSO中的幾個克隆捐贈了幾乎所有的種子和花粉，也許所有的壞圣誕樹都是主要克隆的后代。換句話說，性狀上沒有遺傳變異 - 變化是單純的環境。為了避免對（克?。┛寺〉膬炘叫宰鞒鲥e誤的結論，人們還必須在角色頻譜的另一端（例如，壞的圣誕樹）將基因分類為個體的一部分。這可以證實，好的和壞的樹的父母是不一樣的。技術開發不斷提高了使用DNA標記物進行這種育種的可行性?？煽康亩嘀豍CR試劑盒減少了實驗室工作量，并提供了在同一PCR反應中包含多達10個標記的機會。我們的研究表明，10個標記提供了足夠的親子鑒定成功，即使CSO中克隆數量相對較多。如果PCR和片段分析可以限制在每個樣品一次運行，這將顯著降低實驗室成本，降低數據處理和錯誤風險?；蚍中歪樔~樹技術開發的下一步是生產完全自動化的DNA提取過程。這項研究已經證明了標記在育種計劃開始時的適用性。在理論和實踐兩方面，仍然有待研究，這種方法是否有用，并且與長期的樹種育種相結合，具有更多的先進世代。

結論

在CSO的后代建立一個使用12個微衛星的準實地試驗，產生了有希望的結果，具有較大的育兒成功率。當標記的數量減少到10并且通過排除兩條特定的樹行而不是來自假定的種子來證明其精度時，該方法工作良好。分配親本的大部分后代可能與CSO中低花粉污染密切相關。鑒于分析中包含的樹木數量少，所以定量遺傳參數的估計是令人滿意的。對于高遺傳性狀如潮紅，準確的育種值可以估計為親本基因型的合理分數。然而，諸如圣誕樹品質分數等低遺傳特性需要更多的基因型后代在育種中具有實際價值。該方法的最大缺點是種子果園中父母間親屬分布偏高，難以獲得所有相關克隆的育種價值。這種方法似乎非常適合于改變進行樹種育種的方式，即更加強調基于生產站點中選定個體的基因分型的親代基因型的純選擇，而較少的是估計定量遺傳參數。在技??術上，針葉樹DNA的自動DNA提取將是使針葉樹育種技術更可行的最大的進步。