Nat?Biotech | 埃米級定位揭示細胞更多細節

原創?驕陽似我?圖靈基因?2022-11-18 10:37?發表于江蘇

收錄于合集#前沿分子生物學技術

撰文：驕陽似我

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1、超分辨率技術在納米范圍實現了定位精度。本文報告了在埃米范圍內的全光學，室溫定位。本文建立在MINSTED納米鏡的概念上，通過用受激發射耗盡（STED）環形光束的低強度中心區域包圍熒光團，同時不斷增加環形光束的絕對功率，從而提高精度。

2、通過藍移STED光束和開啟/開關分離熒光團，與DNA鏈結合的單個熒光團用σ = 4.7??

定位，對應于熒光團大小的一小部分，只有2000個檢測光子。通過瞬時DNA雜交成像和哺乳動物細胞中核層膜的分布，模擬了具有個數納米分辨率的MINSTED熒光納米鏡。

3、本文實驗產生了一個定位精度的σ = 2.3 ??估計有10,000個檢測光子，預計這將為細胞中大分子復合物的研究開辟新的應用領域。

自20世紀70年代以來，熒光顯微鏡一直是研究細胞中生物分子分布必不可少的手段。在本世紀之交，STED顯微鏡打破了衍射屏障，對光學分辨率施加了明顯無法克服的物理限制，打開了幾十納米尺度的細胞成像。通過依賴熒光團熒光能力的開關，這種轉變成為可能。最近引入的MINFLUX和MINSTED納米鏡又增加了10倍，從而最終達到了熒光標簽尺度上的分辨率。

近期，在Nature?Biotechnology雜志上發表了一篇名為“MINSTED nanoscopy enters the ?ngstr?m localization range”的文章，報告了MINSTED獲得全光學熒光團定位的精度在埃米范圍。對應于熒光團大小的一部分，這些精度是在室溫下使用STED顯微鏡獲得的。DNA鏈上的單個熒光團用σ = 4.7??進行定位，通過將單個發射軌跡分成2000個光子的重疊塊來測量。對于在這些痕跡中實際探測到的總共10,000個光子，估計了一個精確的σ = 2.3??。在DNA雜交標記的哺乳動物細胞中成像核孔MINSTED納米鏡，該方法稱為DNA PAINT。在大鼠海馬神經元中突觸蛋白分布的MINSTED圖像中也獲得了類似的分辨率。這些進步之所以成為可能，是因為與標準的STED不同，MINSTED納米鏡一次只使用一個開啟狀態的熒光團，而焦點區域的所有其他熒光團都是關閉的。此外，只有一個活性熒光團就可以使STED更有效地實現，從而有利于最終的概念。

本文研究背后的物理原理可以概述如下（圖1）。在幾乎所有的STED顯微鏡中，λSTED被調諧到熒光光譜的非常紅色的邊緣。對于發出紅橙色的熒光團，通常選擇流行的近紅外λSTED= 775 nm。原因是，在室溫下，大多數熒光團的激發光譜深入延伸到發射峰。因此，λSTED較短的STED環形光束傾向于“直接”激發抗Stokes模式下的許多旁觀者熒光團，從而在環形區域產生大量熒光。因此，這種熒光影響了熒光團分離所需的開關對比度（圖1b，c）。隨著受激發發射的熒光團橫截面?隨發射光譜的變化，將λSTED遠移到紅色邊緣會降低?，從而降低每單位STED光束功率的STED效率。隨著功率的增加來補償?的減少，顯然有（熱負荷）限制，當在最好的尺度上定位時變得明顯。

然而，當開/關對比度由STED以外的過程提供時，就像當單個熒光團在活性和非活性狀態之間切換時一樣，λSTED可以被調諧到更接近發射最大值，從而使?變得更大。在這種情況下，STED環形光束“直接”激發引起的背景并不重要，因為所有的熒光團，除了被定位的熒光團，都是不活躍的（圖1c）。較大的?使較低的STED光束功率，從而避免禁止加熱，并使用脈沖二極管激光器（圖1d）。圖1：藍移MINSTED。

藍移λSTED也改變了光學裝置的有效點擴散函數（E-PSF）（圖1b)。E-PSF是λEXC（和λSTED）激發和λSTED去激發的歸一化概率的乘積，代表熒光團在焦點區域某一坐標發射的概率。一般情況下，隨著?和環形光束強度的增加，E-PSF的半最大值全寬（FWHM）變窄。另一方面，由于環形光束的“直接”激發，藍移的λSTED導致了一個基座（圖1b）。雖然這種基座影響了整體STED成像（圖2a，b），但在處理單獨發射體時，這并不重要。

對于發射峰值在≈為570nm的熒光團Cy3B，本文實現了λSTED?= 636 nm，使?達到其全球最大值的28%。這應該與將流行的λSTED?= 775 nm應用于Atto647N等紅色發射熒光團時獲得的≈5%形成對比。共對準的λEXC?= 560 nm激發和STED光束，分別具有電子同步脈沖200 ps和1.4ns的脈沖，通過1.4數值孔徑的油浸物鏡聚焦到樣品中。因此，在STED脈沖能量為1 nJ時，獲得了一個24nm橫向FWHM的E-PSF（圖2c，d）。相比之下，在λSTED?=為775 nm處，需要≈為10nJ的脈沖才能獲得與Atto 647N相同的FWHM。在使用的10mhz重復頻率下，這種藍移導致平均STED光束功率從100 mW減少到10 mW，從而大大降低了熱負荷。注意，將FWHM從共聚焦持續調整到最小FWHM是每個MINSTED熒光團定位的一個組成部分。圖2：藍移STED的對比度和分辨率。

為了通過開/關開關進行分離，首先選擇了在被稱為DNA PAINT的方法中實現的機制：通過DNA雜交，熒光團與感興趣的生物分子目標的瞬時結合。當熒光團與目標結合，從同一坐標發出時，它處于“打開”。相反，當熒光團在周圍的介質中擴散時，它就會“關閉”，只產生一個微弱的背景（圖3）。這種通過結合和擴散進行的開/關調制使能夠避免光可激活和光可切換的熒光團，而是使用常規的熒光團，特別是Cy3B。

因此，PAINT允許使用首選的波長上非常適合STED的染料。DNA PAINT的開/關調制也使多次測量單個結合位點成為可能，這有助于對單個結合位點的定位精度進行統計分析。一般來說，STED與DNA雜交標記的結合具有高度的協同作用，因為當定位結合的熒光團時，STED環形光束抑制了擴散熒光團的背景。STED的使用只是通過添加另一種斷開機制來增加DNA標記的對比度。同樣地，與標準的高分辨率DNA涂料應用相比，這種放大的關閉開關有利于使用更高濃度的擴散標簽，從而可以加速成像。

為了量化藍移MINSTED定位和納米鏡學，使用矩形DNA折紙陣列進行了測量，在12nm周期距離下為單個熒光團提供3×3結合位點。選擇擴散Cy3B熒光團的濃度，每次只有一個熒光團對接到焦點區域內的網格點，而其他熒光團在溶液中自由擴散(圖3b和4a-c）。首先驗證了隨著STED脈沖能量E的增加，信號-背景比（SBR）的增益（圖3b）。為此，光柵掃描了2μm×2μm視場，激發平均功率為1.5μW。由單獨結合的熒光團呈現的熒光峰值從結果圖像中的熒光最大值中提取，而背景則從每像素的平均熒光信號中提取。

關閉激發光束使能夠量化STED光束的“直接”激發。發現主要的背景成分確實是由于激發光束誘導了來自擴散熒光團的熒光。然而，隨著STED脈沖能量E的增加，該成分迅速下降，因為環形光束限制了允許熒光的區域。STED束的“直接”激發隨E的增加，但仍可接受（圖3b）。總之，在1 nJ下得到的SBR = 60比標準共聚焦顯微鏡（E = 0）獲得的SBR高10倍，也沒有像典型的微流量最后定位步驟那樣被犧牲，為高精度定位奠定了基礎。圖3：結合STED與開關和DNA雜交標記。

通過比較單定位估計σest和聚類分析精度σcluster，能夠評估40分鐘測量中結合位點的有效位置不確定性，作為過程中涉及的穩定性的代理。通過對σcluster?(M)?進行建模，得到了一個s=為0.72 nm的值，證明了該系統的長期穩定性。精度和穩定性的結合使我們的藍移MINSTED系統能夠清晰地分辨出接近4 nm的折紙結合位點，這大約是Cy3B分子大小的兩倍（圖4b-f）。用L > Nc注冊所有本地化解決了整個折紙模式。圖4：MINSTED納米鏡定位精度和分辨率。

為了探索藍移MINSTED納米技術在生物樣品中的性能，制備了表達核孔蛋白NUP96的哺乳動物（HeLa）細胞，作為sfGFP標記的多肽，作為抗GFP納米體的結合位點。由于核孔復合體（NPC）在焦平面上的八倍對稱性，像NUP96這樣的NPC支架組件經常被用來評估納米鏡方法的性能。針對這些NUP96多肽的GFP標簽的納米體攜帶一條DNA對接鏈，與Cy3B熒光團的互補DNA鏈能夠通過雜交結合，其中70%的圖像估計中位數σ<為1nm（圖5a-d）。

從數據集中手動選擇所有可識別的NPC（328個NPC包含8116個定位，占數據集中所有定位的78%），并進一步分析它們的定位分布，得到的平均站點占用率為6.8個預計的八倍排列（圖5e)。從這個數據集中，所有有8個被占據位點的NPC都被用于進一步分析，以確保沿孔隙輪廓的良好覆蓋。在估計其橢圓度時，排除了所有長徑比>1.25的NPC。從剩下的81個NPCs中，包括2361個定位，確定了平均直徑為112±6nm（圖5f）。

接下來研究了MINSTED圖像如何與提供NUP96結構信息的三個低溫電子顯微鏡（低溫-em）數據集相匹配。每個NPC的32個全長NUP96多肽的x-y投影結構是根據它們與低溫研磨的DLD-1 NPC的低溫電子顯微鏡圖的擬合進行排列的。附加標簽所在的NUP96c端（氨基酸937）被突出顯示（圖5g)。從選擇的81個NPC中，創建了一個疊加圖像，復制了通過NUP96可視化的NPC的8倍對稱性（圖5h）。這個覆蓋層被用來估計與從低溫電子顯微鏡數據推導出的NUP96位置的擬合。

因為GFP納米體實體是通過柔性連接肽附加到NUP96c端，它可以跨越旋轉自由，一個二維（2D）可能的熒光團位置的圓形區域。在估計的平均長度為7 nm時，包括連接體、GFP和納米體，其中68%的≈定位包含在這些區域內（圖5i）。每個NUP96定位簇的細長外觀沿著外圍，如疊加圖所示，可以解釋為表明NUP96多肽在每個NPC的八角形亞基中輕微交錯排列。考慮到可能的旋轉半徑為7 nm的熒光團位置，低溫電子顯微鏡結構與MINSTED得到的數據很一致（圖5j）。圖5：核孔藍移MINSTED成像。

通過這項測試后，MINSTED納米鏡被應用于沒有表現出與NPC類似對稱排列的結構。具體來說，用抗層膜A/C抗體標記COS-7細胞，這些抗體在靠近抗體結合袋的糖基化位點上有兩條DNA對接鏈。對接鏈通過DNA雜交用于Cy3B標記。該抗體針對層膜蛋白A/C的Ig-fold結構域。記錄熒光團及其位置68分鐘，就得到了層膜分布的納米級分布（圖6a）。雖然該樣品對分離和定位提出了更多的挑戰，但估計的中位數σ為<1 nm。最后用一/二抗夾層標記突觸蛋白2，應用MINSTED來觀察培養大鼠海馬神經元軸突末端密集的突觸囊泡的分布。所得到的MINSTED圖像顯示了直徑為38 ± 23 nm的熒光團簇，與代表突觸囊泡的預期一致（圖6b）。圖6：層膜和突觸囊泡的藍移MINSTED成像。

總之，本文發現藍移MINSTED能夠用400個檢測光子定位單個熒光團，σ = 1 nm，這是一個創紀錄的低數量。需要注意的是，為了實現這種精度，理想的無背景質心定位需要≈11000個光子，這強調了以強度為零定位熒光團的好處。減少所需的檢測數量也減少了運動和漂移的影響。接近4 nm的熒光團可以完全分離，還不需要進一步的數據后處理或漂移校正。這一成功是因為：(1) MINSTED以STED環形光束最小值提供樣品中的參考坐標，(2)不斷移動靠近熒光團，使去激發速率保持不變；(3) STED和共焦檢測抑制熒光背景；(4)低功率光束可以避免通過加熱而產生的細微干擾。

最后注意到所獲得的精度記錄仍然可以改進，而不修改最低限度的概念。由于檢測率與二極管激光器的脈沖重復率成正比，將速率從目前的10 MHz增加到50-100MHz應該幾乎相應地加快定位。隨著激光技術的快速發展，這種情況可能很快就能在毫秒域內實現1nm精度的精確定位，從而適應更快的運動和漂移。同樣地，具有1-?精度的熒光團定位也應該成為一種常規方法。

教授介紹：

Stefan W. Hell?

Stefan Hell，全稱Stefan Walter Hell，（1962年12月23日出生于羅馬尼亞阿拉德），羅馬尼亞出生的德國化學家，因使用熒光分子繞過光學顯微鏡固有的分辨率限制而獲得2014年諾貝爾化學獎。他與美國化學家W.E. Moerner和美國物理學家Eric Betzig分享了該獎項。

1978年，Stefan Hell和他的家人從羅馬尼亞移民到德國。他在海德堡大學學習物理學，1987年獲得文憑，1990年獲得博士學位。從1991年到1993年，他是海德堡歐洲分子生物學實驗室的博士后研究員，從1993年到1996年，他是芬蘭圖爾庫大學激光顯微鏡小組的首席科學家。他于1997年回到德國，成為哥廷根馬克斯普朗克生物物理化學研究所的研究小組組長。2002年，他成為該研究所所長。

參考文獻：

Weber, M., von der Emde, H., Leutenegger, M.et al.MINSTED nanoscopy enters the ?ngstr?m localization range.Nat Biotechnol(2022). https://doi.org/10.1038/s41587-022-01519-4