一、標本的采集、處理與運輸
用于病毒分離和鑒定的標本應在病程初期or急性期采集
保存：標本放入凍存液并<u>加入甘油or二甲基亞砜（DMSO）</u>、存放-70℃保存。
二、病毒的培養條件
<u>實驗動物、雞胚、體外培養的器官和細胞</u>
- 組織培養
組織培養用玻璃器皿用硫酸、重絡酸鉀溶液浸泡后再清洗應用
常用<u>MEM、RPMI1640</u>
<u>碳酸氫鈉</u>→調節pH
<u>HEPES溶液</u>→pH緩沖能力
分散成單個細胞的化學制劑：胰蛋白酶、EDTA（Versen溶液）
EDTA作用原理：可以結合鈣、鎂離子、使組織細胞分散。
細胞生長液和細胞維持液主要區別：<u>血清含量不同</u>。
適宜pH 7.2~7.6、全過程關鍵→<u>防止污染</u>。 - 細胞株的保存
含10%二甲基亞砜的血清在液氮中保存細胞。 - 使用的細胞類型
原代細胞、二倍體細胞、傳代細胞 三大類（根本區別：能否在體外無限傳代） - 細胞的純化
用細胞克隆技術、克隆：無性繁殖、遺傳上相同的。
三、病毒病的常規實驗室診斷
（一）病毒的分離和鑒定
病毒對細胞的感染性具嚴格的選擇性和特異性，因此必須首先選擇敏感細胞。
- 病毒增殖的判定
形態學和病理學變化 - 細胞病變（CPE）
表現為<u>嚴重的細胞破壞、細胞腫大、顆粒增多、細胞融合成-合胞體</u>or無明顯的細胞變化
CPE常具有病毒“種”的特性--鑒定依據之一 - 病毒蝕斑（空斑）技術
單層細胞上形成的局限性病灶，主要用于病毒的<u>純化or病毒含量的測定</u>。 - 病毒感染力的滴定
- 用實驗動物測定LD50（半數致死量）
- 在組織細胞上測定TCID50（半數細胞培養物感染量）
- 病毒的保存：冷凍干燥-可長期保存
（二）病毒形態學檢查
- 光學顯微鏡 僅用于大病毒顆粒<u>（如痘類病毒）和病毒包涵體</u>的檢查
- 電子顯微鏡檢查法
-
電鏡直接檢查法
標本粗提濃縮→磷鎢酸鹽負染→直接觀察 -
免疫電鏡檢查法（更特異、更敏感）
病毒標本制成懸液→加入特異性抗體→病毒顆粒凝集成團→電鏡觀察、檢測率↑ - 超過濾法
不同孔徑火棉膠濾膜過濾病毒懸液→接種or血凝試驗測定是否通過→估計病毒大小 - 超速離心法
病毒大小→沉降速度不同→測病毒的沉降系數（S）→計算病毒大小 - X線晶體衍射法
X線衍射圖譜→數學處理→病毒結構亞單位&分子結構
標本必須為晶體、可研究<u>無包膜病毒</u>。
（三）免疫學鑒定
用已知的抗病毒血清or單克隆抗體→免疫-血清學試驗→鑒定病毒的種類、型別
（四）病毒的分子生物學鑒定
分子生物學診斷的特異性取決于核酸序列的特異性。
- 核酸測定 PCR、探針技術、核酸序列測定
- 蛋白質測定 免疫測定技術、電泳技術、質譜技術
